Митохины при ХОБЛ

ВВЕДЕНИЕ Хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ) характеризуется прогрессирующей и труднообратимой обструкцией дыхательных путей, при которой в основном поражаются мелкие дыхательные пути (хронический обструктивный бронхиолит), в различной степени связанной с деструкцией легочной паренхимы (эмфиземой). 10% людей старше 45 лет страдают ХОБЛ. Ожидается, что к 2020 году ХОБЛ станет третьей ведущей причиной смертности в мире. Ведущей причиной ХОБЛ в западных странах является хронический контакт табачного дыма с дыхательными путями с массивным поступлением в организм многих токсических веществ и активных форм кислорода (АФК), вызывающих окислительный стресс (ОС). ОС при ХОБЛ бывает как экзогенной (вдыхание АФК), так и эндогенной (АФК, индуцированной табачными токсинами и собственным заболеванием). Некоторые исследователи считают, что ОС при ХОБЛ тесно связана со своеобразным типом ускоренного клеточного старения, связанного с хроническим воспалительным процессом, поражающим не только дыхательную систему, но и многие другие отделы организма (скелетные мышцы, сердечно-сосудистую систему, глобальный обмен веществ). , иммунологическая система и др.).

Митохондриальная дисфункция играет центральную, но не исключительную роль в окислительном стрессе, клеточном старении и хроническом воспалении. Следовательно, лучшее понимание митохондриальной дисфункции, лежащей в основе ХОБЛ, позволит лучше понять физиопатологию и определить новые возможные терапевтические мишени. Митохондриальные изменения ХОБЛ в бронхолегочной, мышечной и иммунологической областях широко документированы как морфологически, так и патофизиологически. Митохондриальная дисфункция может быть первичной (врожденной) или вторичной (приобретенной, как в случае курения табака). Это широкое понятие, включающее нарушение выработки клеточной энергии, чрезмерное образование АФК или некоторых метаболитов цикла Кребса в митохондриях и потерю контроля качества основных митохондриальных компонентов, что в конечном итоге приводит к аномальному выходу внутримитохондриальных молекул (мтДНК, АТФ, цитохром с, Romo1 и др.) в цитозоль и внеклеточную жидкость. Некоторые из этих молекул ведут себя как DAMP (молекулярные паттерны, связанные с повреждением) и вызывают активацию врожденного иммунитета и, следовательно, воспаление. Уровни цитохрома C и Romo1 в крови были предложены в качестве маркеров окислительного стресса. Основной функцией митохондрий является выработка АТФ, основной молекулы-носителя энергии для поддержания жизнедеятельности живой клетки. Генерация АТФ производится из других предшественников энергии в митохондриях через систему окислительного фосфорилирования, связанную с цепью переноса электронов (OXPHOS/ETC). Эти органеллы также играют фундаментальную роль в 1) образовании специфических метаболитов углеводов, липидов и белков, которые необходимы для множества клеточных функций, 2) синтезе гемов и стероидных гормонов, 3) управлении «кластерами» Fe и S, 4) клеточный гомеостаз внутриклеточного кальция, 5) иммунный ответ, как врожденный, так и приобретенный, и 6) регуляция некоторых видов апоптоза.

Клетки постоянно реагируют на изменения окружающей среды, которым они подвергаются. В ситуациях клеточного стресса (например, калорийная депривация, нехватка определенных питательных веществ, изменения температуры и т. д.) клеточное ядро ​​реагирует, посылая сигналы митохондриям, чтобы они модифицировали свою функцию, чтобы адаптироваться к изменениям (антероградная передача сигналов от ядра к митохондриям: например, физические упражнения потребляют АТФ в мышечной клетке, который активирует AMPK, который активирует ядерный кофактор транскрипции PGC-1alpha, который, в свою очередь, активирует OXPOS/ETC и митохондриальный биогенез). С другой стороны, при возникновении стрессовой ситуации в самих митохондриях (напр. избыточное производство свободных радикалов кислорода, несвернутые внутримитохондриальные белки и т. д.) в ядро ​​посылаются сигналы для изменения продукции белков, предназначенных для предотвращения/коррекции митохондриального повреждения, включая шапероны, антиоксиданты или протеолитические ферменты, протеолитические (автономная или внутриклеточная ретроградная передача сигналов) .

Недавно было показано, что митохондрии способны прямо или косвенно генерировать пептиды, которые не только влияют на собственную клетку, которая их производит, но и оказывают дистанционное воздействие (неавтономная или внеклеточная ретроградная передача сигналов). Эти вещества, открытые группой Диллина, называются митохинами и посылают сигналы от тканей с напряженными митохондриями всему телу, являясь гормонами, которые подготавливают весь организм к ответу на клеточный стресс, которому он будет подвергаться.

Митохины высвобождаются при каком-либо митохондриальном стрессе (врожденные или приобретенные мутации в мтДНК, нарушения OXPHOS/ETC, вызывающие окислительный стресс, митохондриальные токсины и т. д.). У млекопитающих митохондриальный стресс обычно связан с так называемым интегрированным клеточным ответом на стресс (ICRS)». Одним из наиболее важных механизмов ICRS является UPR (реакция развернутого белка), в котором митохондрии участвуют скоординировано с системой эндоплазматического ретикулума и ядром клетки.

Существует как минимум два различных типа митохинов: 1) первичные митохины, закодированные в митохондриальной ДНК (мтДНК) и 2) вторичные митокины, закодированные в ядре ДНК (яДНК), секреция которых регулируется с помощью сигналов активации от стрессированных митохондрий к нДНК (например, ATF4 и др.). Гуманин (HN), MOTS-c (митохондриальная ORF Двенадцати S-c) и шесть пептидов, сходных с гуманином (SHLP 1-6), считаются первичными митохинами, хотя их число может быть больше. До недавнего времени считалось, что митохондриальная ДНК кодирует только 37 генов (13 пептидов, обнаруженных исключительно в митохондриях, все они являются субъединицами ЭТЦ, 22 транспортные РНК -тРНК- и 2 рибосомные РНК -рРНК-) РНК. Теперь мы знаем, что 16s и 12s рРНК содержат sORF («короткие открытые рамки считывания»), которые транслируют секреторные пептиды из 20-30 а.о. Неизвестно, какие интимные механизмы регулируют синтез и высвобождение этих митохинов, хотя возможно, что они связаны с активацией митохондриальных рибосом. Из вторичных митохинов (закодированных в ядерной ДНК) при активации ATF4 известны фибробластический фактор роста 21 (FGF21), фактор роста и развития 15 (MIC1/GDF15), фоллистатин и интермедин-адреномедуллин2. Эти митохины также реагируют на другие стимулы, независимые от митохондрий.

Гуманин представляет собой пептид из 21 или 24 а.о. с множественными цитопротекторными функциями против митохондриального повреждения (увеличивает синтез антиоксидантов и шаперонов для 4 развернутых белков). Он оказывает противовоспалительное (снижает уровень воспалительных цитокинов и повышает уровень противовоспалительных цитокинов) и антиапоптотическое (блокирует факторы апоптоза, такие как Bak и IGFBP3), через по крайней мере 2 мембранных рецептора и несколько взаимодействий с другими внутриклеточными и внеклеточными белками во многих тканях. (нервная система, печень, сердце, сосудистая стенка, скелетные мышцы, пигментный эпителий сетчатки, гонады и др.). Он также оказывает благоприятное метаболическое действие (снижает резистентность к инсулину на центральном уровне, защищает бета-клетки поджелудочной железы от окислительного стресса и имеет отрицательную обратную связь с IGF1). Недавно было доказано, что люди с высоким уровнем этого гормона имеют меньше когнитивных нарушений с возрастом, а также очень долгожители.

MOTS-c — еще один небольшой пептид из 16 а.о., кодирующий мтДНК, но синтезируемый исключительно в цитозольных рибосомах, который также обладает благотворным антиоксидантным и метаболическим действием, поскольку снижает резистентность к инсулину и предотвращает ожирение. С другой стороны, он повышает устойчивость к некоторым инфекциям, увеличивает и уменьшает резорбцию костей, поэтому может оказывать антиостеопоротическое действие. Оба гормона можно измерить в крови с помощью ИФА, хотя существуют определенные расхождения в их уровнях в плазме в зависимости от используемого теста.

FGF21 представляет собой хорошо изученный гормон, стимулирующий кетогенез и бета-окисление жирных кислот. Его секреция регулируется голоданием и активацией рецепторов PPAR-α, но также известно, что она повышается в любой ситуации митохондриального стресса, который активирует митохондриально-ядерные сигналы. MIC1/GDF15 является еще одним циркулирующим гормоном, который уменьшает чувство голода, активируя специфический уровень рецепторов (GFRAL), обнаруженный в области postrema и ядрах солитарного тракта. Повышенные уровни GDF15 обнаружены при раковой кахексии и во многих других ситуациях, в том числе при ХОБЛ. Он также высвобождается, когда активируются сигналы от митохондрий к ядру. При ХОБЛ из всех рассмотренных здесь митохинов имеется информация только об уровнях GDF15 в крови, но в литературе нет данных об уровнях других митохинов. По мере прогрессирования ХОБЛ уровни митохинов в крови, вероятно, будут прогрессивно повышаться, выражая дальнейшее ухудшение функции митохондрий, хотя их уровни могут увеличиваться только до определенного уровня, а затем уменьшаться, когда повреждение митохондрий становится невыносимым, что представляет собой своего рода митогорметический ответ. ГИПОТЕЗА Митохины, экспрессируемые в контексте митохондриальной дисфункции, изменяются у пациентов с ХОБЛ и связаны с наихудшими клиническими исходами. Кроме того, митохины могут использоваться в качестве прогностических факторов и потенциальных терапевтических мишеней при ХОБЛ. ЦЕЛИ

1. - Описать уровни митохинов в контрольной группе, группе амбулаторных больных со стабильной ХОБЛ и группе больных с обострением ХОБЛ.
2. - Описать различия в уровне полутонов в разных группах больных ХОБЛ (разная степень обструкции, пациенты с высоким риском обострения и отсутствием риска обострения, пациенты с оценкой по шкале CAT<10 по сравнению с остальными пациентами, пациенты с низким уровнем обезжиривания). Индекс массы (ИММ) по сравнению с остальными пациентами).
3. -Для оценки корреляции между полутонами и различными клиническими исходами, такими как ИМФП, расстояние, пройденное в тесте 6-минутной ходьбы, ОФВ1, оценка CAT.
4. - Оценить, можно ли использовать митохины для прогнозирования будущего риска обострения и госпитализации.

МЕТОДЫ

Исследуемая популяция

Критерии включения и исключения:

Пациенты со стабильной ХОБЛ: будут отобраны из поликлиники пульмонологии больницы.

Университет маркиза де Вальдесилья. Пациенты с ХОБЛ должны соответствовать следующим критериям:

40 лет и старше с исходным объемом форсированного выдоха после бронходилататора в 1 с [ОФВ1]/форсированной жизненной емкости легких [ФЖЕЛ] ≤0,70.

Пациенты с обострением ХОБЛ: будут выбраны из пациентов, поступивших в больницу Universitario Marqués de Valdecilla с диагнозом обострения ХОБЛ.

Контрольная группа: будет получена от пациентов без ХОБЛ или любого другого острого или хронического респираторного заболевания и родственников пациентов.

Приняв альфа-риск 0,05 и бета-риск 0,2 в двустороннем тесте, необходимо 30 субъектов в первой группе и 90 во второй, чтобы найти статистически значимую разницу пропорций, которая, как ожидается, составит 0,45 в группе 1 и 0,1 в группе 2. , Ожидая процент отсева 5%. Приближение ARCSINUS. Этот расчет был выполнен в соответствии с ранее опубликованными исследованиями, проведенными нашей группой. Мы рассчитываем простой размер 120 пациентов с ХОБЛ, 30 пациентов с обострением ХОБЛ и 30 контрольных.

Целевой охват/размер выборки 180 Ожидаемый уровень охвата 25 пациентов в месяц Предполагаемая дата начала исследования: Образцы собраны в Биобанке с 01.12.2019 Образцы отправлены в лабораторию биохимии 01.03.2020 Предполагаемая дата завершения исследования: (окончание наблюдения) 05.04.2021 Дизайн и методы исследования Наблюдательное проспективное исследование. Пациентов будут набирать из амбулаторных клиник ХОБЛ, амбулаторных клиник по прекращению курения и пациентов, госпитализированных в связи с обострением ХОБЛ. Всем пациентам будет дано письменное информированное согласие на участие. Это исследование уже было одобрено Этическим комитетом Кантабрии (CEIC).

Участники

1. Стабильная ХОБЛ (40 лет и старше с исходным объемом форсированного выдоха после бронходилататора в 1 с [ОФВ1]/форсированная жизненная емкость легких [ФЖЕЛ] ≤0,70) будут набраны во время их регулярного последующего наблюдения.
2. Контрольная группа: добровольцы того же возраста и пола без предшествующего диагноза ХОБЛ или других респираторных заболеваний и с постбронхолитическим объемом форсированного выдоха за 1 с [ОФВ1]/форсированной жизненной емкости легких [ФЖЕЛ] >0,70.
3. Пациенты с обострением ХОБЛ: пациенты с предыдущим диагнозом ХОБЛ (40 лет и старше с исходным объемом форсированного выдоха после бронходилататора в 1 с [ОФВ1]/форсированная жизненная емкость легких [ФЖЕЛ] ≤0,70), госпитализированные в пульмонологическое отделение больницы из-за обострения ХОБЛ.

Индекс коморбидности Чарлсона будет зарегистрирован у всех участников исследования. Пациенты с обострениями за 1 месяц до исследования, пациенты, включенные в легочную реабилитацию во время исследования или за 6 месяцев до периода включения, с другими потенциальными причинами саркопении (злокачественные заболевания, сердечная недостаточность, гипертиреоз или другие хронические деструктивные заболевания) и пациенты с известные хронические заболевания почек или недавнее острое повреждение почек будут исключены из исследования. Образцы крови и все другие измерения будут сделаны в тот же день, когда пациенты примут участие в исследовании.

Клинические характеристики

При включении в исследование пациенты с ХОБЛ будут разделены на разные категориальные группы: (1) бессимптомные пациенты (оценочный тест ХОБЛ [CAT] <10 баллов) по сравнению с пациентами с симптомами (CAT ≥10 баллов), (2) пациенты без одышки (модифицированная оценка одышки Совета медицинских исследований [mMRC] < 2) по сравнению с пациентами с одышкой (mMRC ≥2), пациенты с высоким риском обострения (с 2 или более обострениями, требующими лечения антибиотиками или системными стероидами или по крайней мере с одной госпитализацией в предшествующей год) по сравнению с пациентами с низким риском обострения и (4) бывшие курильщики по сравнению с активными курильщиками. После включения в исследование будут получены образцы крови, и пациенты будут наблюдаться в течение 1 года (одно посещение через 6 месяцев и одно посещение через 12 месяцев), а обострения и госпитализации будут регистрироваться проспективно. В течение последующего периода все клинические исследователи, участвующие в исследовании, не будут знать результатов митохинов. В течение этого периода пациенты с возможными легочными обострениями будут проинструктированы беспрепятственно обращаться в отделение неотложной помощи больницы, и эта команда врачей будет свободно решать, госпитализировать их или нет, в соответствии со своими собственными клиническими критериями.

В соответствии с уровнями митохинов пациенты будут разделены на две группы: одна состоит из лиц, находящихся в самом высоком квартиле митохинов, а другая группа будет включать пациентов из трех других квартилей уровней митохинов.

Измерения Базальная одышка будет регистрироваться с использованием шкалы одышки mMRC. Оценка CAT будет записана с помощью самостоятельно заполняемой анкеты. Предыдущие обострения будут зарегистрированы в истории болезни пациентов, включенных в исследование. Спирометрия будет измеряться в соответствии с Американским торакальным обществом/Европейским респираторным обществом (ATS/ERS) у всех субъектов.

Состав тела будет оцениваться с помощью устройства биоэлектрического импеданса (OMROM BF511, Omrom, Япония), а FFMI будет рассчитываться как отношение FFM к росту в метрах в квадрате. Тест 6-минутной ходьбы будет проводиться в соответствии с протоколом Американского торакального общества: пациентов просили пройти столько, сколько они могут за 6 минут по 30-метровому прямому коридору без перерыва. В конце теста будет зарегистрировано расстояние, пройденное пациентами, и одышка. Гуманин и MOTS-c будут измеряться с помощью ELISA (Mybiosource), FGF21 и GDF15. Будет измерено с помощью ELISA (Quantikine). Если возможно, Romo1 также будет измерен с помощью ELISA. Исследование будет разделено на 3 визита: ВИЗИТ 1: Сбор образцов крови и клинические характеристики. ВИЗИТ 2: через 6 месяцев после визита 1: Обострения и госпитализации (количество и дата) после визита 1. ВИЗИТ 3: через 12 месяцев после визита 1: Обострения и госпитализации (количество и дата) после визита 2.

Конечные точки исследования Первичная конечная точка: митохины можно использовать для оценки риска госпитализации у пациентов с ХОБЛ.

Вторичные конечные точки:

1. -Митохины могут быть использованы для оценки риска обострения ХОБЛ у пациентов с ХОБЛ.
2. - Митохины изменены у пациентов с ХОБЛ.
3. - Митохины изменяются при обострении ХОБЛ.
4. - Митохины коррелируют с различными переменными ХОБЛ (FEV1, FFMI..).

Статистический план или анализ данных. Данные будут представлены как среднее ± стандартное отклонение для нормально распределенных данных или медиана (межквартильный размах) для непараметрических данных. Различия между группами будут проанализированы с использованием непарных t-тестов для параметрических данных или тестов Манна-Уитни для непараметрических данных.

Корреляции между наборами данных исследовали с использованием коэффициента корреляции Пирсона (r) для параметрических данных или коэффициента ранговой корреляции Спирмена (rs) для непараметрических данных. Нормальное распределение будет проверено с помощью теста Колмогорова-Смирнова.

Оценки Каплана-Мейера будут использоваться для расчета доли участников, у которых есть событие с течением времени. Одномерный и многомерный анализ с использованием пропорционального анализа риска Кокса будет проводиться с использованием программного обеспечения SPSS версии 25.00 для ПК для анализа развития первых событий в соответствии с базальными уровнями митохинов и выявления факторов риска, связанных с обострениями и госпитализацией. Различия будут считаться значимыми, если значения p будут меньше 0,05. Все сообщаемые значения p будут двусторонними.

Ограничения и этические соображения Это одноцентровое исследование, поэтому его необходимо воспроизвести в многоцентровых исследованиях с участием большего числа пациентов из разных стран. Несмотря на то, что они дороги и сложны, некоторые методы, такие как биопсия мышц, эргометрия, количественная оценка мышечной массы с помощью КТ или челночного теста, могут быть выполнены для того, чтобы иметь лучшее представление о мышечной массе и функции у этих пациентов.

От этого исследования не ожидается никакого потенциального вреда для пациентов. Это исследование было одобрено комитетом по этике Кантабрии (код: :2018.276). Хотя исследование финансируется компанией GlaxoSmithKline (GSK), оно является независимым исследованием, и исследователи не получают никакой финансовой компенсации.