Mitokiner ved KOL

INDLEDNING Kronisk obstruktiv lungesygdom (KOL) er karakteriseret ved progressiv og næppe reversibel obstruktion af luftvejene, som grundlæggende påvirker de små luftveje (kronisk obstruktiv bronchiolitis), varierende forbundet med ødelæggelse af lungeparenkymet (emfysem). 10 % af personer over 45 år har KOL. KOL forventes at være den tredje hyppigste årsag til dødelighed i verden i 2020. Den førende årsag til KOL i vestlige lande er kronisk tobaksrøgskontakt med luftvejene, med massiv indtrængning af mange giftige stoffer og reaktive oxygenarter (ROS) til kroppen, som inducerer oxidativt stress (OS). OS i KOL er både eksogent (ROS-inhaleret) og endogent (ROS induceret af tobakstoksiske stoffer og af egen sygdom). Nogle forskere mener, at OS i KOL er tæt forbundet med en ejendommelig type accelereret cellulær alderdom forbundet med en kronisk inflammatorisk proces, som ikke kun påvirker åndedrætssystemet, men også mange andre dele af kroppen (skeletmuskulatur, kardiovaskulært system, global metabolisme). immunologisk system osv.).

Mitokondriel dysfunktion spiller en central, men ikke udelukkende, rolle i oxidativt stress, cellulær alderdom og kronisk inflammation. Derfor ville en bedre forståelse af den mitokondrielle dysfunktion, der ligger til grund for KOL, gøre det muligt bedre at forstå fysiopatologien og identificere nye mulige terapeutiske mål. De mitokondrielle ændringer af KOL i de bronkopulmonale, muskulære og immunologiske områder er bredt dokumenteret både morfologisk og patofysiologisk. Mitokondriel dysfunktion kan være primær (medfødt) eller sekundær (erhvervet, som i tilfælde af tobaksrygning). Det er et bredt begreb, der inkluderer nedsat cellulær energiproduktion, overdreven generering af ROS eller af nogle metabolitter fra Krebs-cyklussen i mitokondrierne og tab af kvalitetskontrol af essentielle mitokondrielle komponenter, der til sidst fører til unormal produktion af intramitokondrielle molekyler (mtDNA, ATP, cytochrom c, Romo1 osv.) til cytosolen og ekstracellulære væsker. Nogle af disse molekyler opfører sig som DAMP'er (skadeassocierede molekylære mønstre) og inducerer en aktivering af medfødt immunitet og dermed inflammation. Blodniveauer af Cytochrom C og Romo1 er blevet foreslået som markører for oxidativt stress. Mitokondriernes hovedfunktion er dannelsen af ​​ATP, det grundlæggende energibærende molekyle til vedligeholdelse af den levende celle. Genereringen af ​​ATP produceres fra andre energiprækursorer i mitokondrierne gennem det oxidative phosphoryleringssystem koblet til elektrontransportkæden (OXPHOS/ETC). Disse organeller spiller også en fundamental rolle i 1) dannelsen af ​​specifikke metabolitter af kulhydrater, lipider og proteiner, som er essentielle for flere cellulære funktioner, 2) syntesen af ​​hæm og steroidhormoner, 3) håndteringen af ​​"klyngerne" af Fe og S, 4) cellulær homeostase af intracellulært calcium, 5) immunrespons, både medfødt og erhvervet, og 6) regulering af nogle typer af apoptose.

Celler reagerer kontinuerligt på de miljømæssige ændringer, som de udsættes for. I situationer med cellulær stress (f. kaloriemangel, mangel på specifikke næringsstoffer, ændringer i temperatur osv.) cellekernen reagerer ved at sende signaler til mitokondrierne, så de ændrer deres funktion til at tilpasse sig ændringen (anterograd signalering fra kernen til mitokondrierne: fysisk træning tærer f.eks. ATP i muskelcellen, som aktiverer AMPK, som aktiverer nuklear transkriptionskofaktoren PGC-1alpha, som igen aktiverer OXPOS/ETC og mitokondriel biogenese). På den anden side, når der er en stressende situation i mitokondrierne selv (f.eks. overdreven produktion af frie iltradikaler, udfoldede intramitokondrielle proteiner osv.) sendes signaler til kernen for at modificere produktionen af ​​proteiner beregnet til at forhindre/korrigere mitokondriel skade, herunder chaperoner, antioxidanter eller proteolytiske enzymer proteolytisk (autonom eller intracellulær retrograd signalering) .

Mitokondrier har for nylig vist sig at være i stand til direkte eller indirekte at generere peptider, der ikke kun påvirker den egen celle, der producerer dem, men de har effekter på afstand (ikke-autonom eller ekstracellulær retrograd signalering). Disse stoffer, opdaget af Dillins gruppe, kaldes mitoquiner og sender signaler fra væv med stressede mitokondrier til hele kroppen, idet de er hormoner, der forbereder hele organismen til at reagere på den cellulære stress, den vil blive udsat for.

Mitoquiner frigives, når der er nogen form for mitokondrielt stress (medfødte eller erhvervede mutationer i mtDNA, lidelser i OXPHOS/ETC, der genererer oxidativt stress, mitokondrietoksiner osv.). Hos pattedyr er mitokondrie stress generelt forbundet med den såkaldte integrerede cellulære respons på stress (ICRS)". En af de vigtigste mekanismer ved ICRS er UPR (Unfolded protein response), hvor mitokondrier deltager på en koordineret måde med det endoplasmatiske retikulumsystem og cellekernen.

Der findes mindst to forskellige typer mitokiner: 1) primære mitokiner, kodet i mitokondrielt DNA (mtDNA) og 2) sekundære mytokiner, kodet i kerne-DNA (nDNA), hvis sekretion reguleres gennem aktiveringssignaler fra de stressede mitokondrier til nDNA (f.eks. ATF4 osv.). Humanin (HN), MOTS-c (Mitochondrial ORF of the Twelve S-c) og seks peptider svarende til humanin (SHLPs 1-6) betragtes som primære mitokiner, selvom antallet kan være højere. Indtil for nylig har man troet, at mitokondrie-DNA kun kodede for 37 gener (13 peptider, der udelukkende findes i mitokondrierne, alle underenheder af ETC, 22 transfer-RNA'er -tRNA- og 2 ribosomale RNA'er -rRNA-) RNA'er. Vi ved nu, at 16s og 12s rRNA indeholder sORF'er ("korte åbne læserammer"), der translaterer sekretoriske peptider fra 20-30 aa. Det vides ikke, hvilke intime mekanismer der regulerer syntesen og frigivelsen af ​​disse mitokiner, selvom det er muligt, at de er relateret til en mitokondriel ribosomal aktivering. Med hensyn til sekundære mitokiner (dem kodet i nuklear DNA) under aktiveringen af ​​ATF4 kender vi fibroblastisk vækstfaktor 21 (FGF21), vækst- og udviklingsfaktor 15 (MIC1/GDF15), follistatin og intermedin-adrenomedullin2. Disse mitokiner reagerer også på andre stimuli, uafhængigt af mitokondrierne.

Humanin er et peptid på 21 eller 24 aa, med flere cytobeskyttende funktioner mod mitokondriel skade (øger syntesen af ​​antioxidanter og chaperoner for 4 udfoldede proteiner). Det er anti-inflammatorisk (sænker de inflammatoriske cytokiner og hæver de anti-inflammatoriske cytokiner) og antiapoptotisk (blokerer apoptotiske faktorer såsom Bak og IGFBP3), gennem mindst 2 membranreceptorer og adskillige interaktioner med andre intracellulære og ekstracellulære proteiner, i mange væv (nervesystem, lever, hjerte, karvæg, skeletmuskulatur, retinalt pigmentepitel, kønskirtler osv.). Det har også gavnlige metaboliske virkninger (nedsætter insulinresistens på centralt niveau, beskytter bugspytkirtlens beta-celle mod oxidativt stress og har negativ feedback med IGF1). For nylig er det blevet bevist, at personer med høje niveauer af dette hormon har mindre kognitiv svækkelse med alderen og også er meget langvarige.

MOTS-c er et andet lille peptid på 16 aa, kodet mtDNA, men syntetiseret udelukkende i de cytosoliske ribosomer, som også har gavnlige antioxidanter og metaboliske virkninger, da det nedsætter insulinresistens og forhindrer fedme. På den anden side øger det modstanden mod nogle infektioner, øger og mindsker knogleresorptionen, så det kan have antiosteoporotiske virkninger. Begge hormoner kan måles i blodet ved ELISA, selvom der er visse uoverensstemmelser i deres plasmaniveauer afhængigt af den anvendte test.

FGF21 er et velkarakteriseret hormon, der stimulerer ketogenese og beta-oxidation af fedtsyrer. Dets sekretion reguleres af faste og aktivering af receptorer PPAR-α, men det er også kendt, at det stiger i enhver situation med mitokondriel stress, der aktiverer mitokondrier-til-kerne-signaler. MIC1/GDF15 er et andet cirkulerende hormon, der reducerer sult og aktiverer et specifikt receptorniveau (GFRAL), der findes i postrema-området og kernen i solitærkanalen. Forhøjede niveauer af GDF15 er blevet fundet i cancer kakeksi og i mange andre situationer, blandt dem KOL. Det frigives også, når mitokondrie-til-kerne-signalerne aktiveres. Ved KOL er der af alle de her gennemgåede mitokiner kun information vedrørende GDF15-blodniveauer, men der er ingen data i litteraturen vedrørende niveauerne af de andre mitokiner. Efterhånden som KOL skrider frem, vil mitoquiner-blodniveauer sandsynligvis stige progressivt, hvilket udtrykker yderligere forringelse af mitokondriel funktion, selvom deres niveauer kun kan stige op til et vist niveau, og derefter falde, når mitokondriel skade er uudholdelig, og dermed udgøre en slags mitohormetisk respons. HYPOTESE Mitoquiner, udtrykt i sammenhæng med mitokondriel dysfunktion, ændres hos KOL-patienter og er forbundet med de værste kliniske resultater. Endvidere kan mitokiner bruges som prognostiske faktorer og potentielle terapeutiske mål ved KOL. MÅL

1. - At beskrive mitokvinniveauer i en kontrolgruppe, en gruppe stabile KOL ambulante patienter og en gruppe af forværrede KOL-patienter.
2. - At beskrive forskelle i halvtoneniveauer i forskellige grupper af KOL-patienter (forskellige niveauer af obstruktion, patienter med høj risiko for eksacerbation vs. ingen risiko for eksacerbation, patienter med CAT-score <10 vs. resten af ​​patienter, patienter med lav fedtfri- Masseindeks (FFMI) vs. resten af ​​patienterne).
3. -For at evaluere sammenhængen mellem halvtoner og forskellige kliniske resultater såsom FFMI, gået distance i 6 minutters gangtest, FEV1, CAT-score.
4. - At evaluere, om mitokiner kan bruges til at forudsige fremtidig risiko for forværring og hospitalsindlæggelse.

METODER

Studiepopulation

Inklusions- og eksklusionskriterier:

Stabile KOL-patienter: vil blive udvalgt fra pneumologiske ambulatorier fra Hospital

Universitario Marqués de Valdecilla. Patienter med KOL skal opfylde følgende kriterier:

40 år eller ældre med baseline post-bronkodilatator forceret ekspiratorisk volumen på 1 s [FEV1]/forceret vitalkapacitet [FVC] ≤0,70.

Forværrede KOL-patienter: Vil blive udvalgt blandt patienter indlagt på Hospital Universitario Marqués de Valdecilla med diagnosen KOL-eksacerbation.

Kontrolgruppe: vil blive indhentet fra patienter uden KOL eller anden akut eller kronisk respiratorisk tilstand og patienters pårørende.

Accept af en alfa-risiko på 0,05 og en beta-risiko på 0,2 i tosidet test 30 forsøgspersoner er nødvendige i den første gruppe og 90 i den anden for at finde en statistisk signifikant forskel, der forventes at være på 0,45 i gruppe 1 og 0,1 i gruppe 2 Forventer et frafald på 5 %. ARCSINUS-tilnærmelsen. Denne beregning er udført i henhold til tidligere offentliggjorte undersøgelser udført af vores gruppe. Vi beregner en simpel størrelse på 120 patienter med KOL, 30 patienter med KOL-eksacerbation og 30 kontroller.

Målindskrivning/prøvestørrelse 180 Forventet indskrivningsrate 25 patienter hver måned Estimeret studiestartdato: Prøver indsamlet i Biobank fra 01.12.2019 Prøver sendt til biokemi laboratorium 01.03.2020 Estimeret afslutningsdato for undersøgelsen: (afslutning på opfølgning) 05.04.2021 Undersøgelsesdesign og metoder Observationel prospektiv undersøgelse. Patienter vil blive rekrutteret fra KOL-ambulatorier, Rygestop-ambulatorier og fra patienter indlagt på grund af KOL-eksacerbation. Alle patienter vil få skriftligt informeret samtykke til at deltage. Denne undersøgelse var allerede godkendt af Cantabrias etiske komité (CEIC).

Deltagere

1. Stabil KOL (40 år eller ældre med baseline post-bronkodilatator tvungen ekspiratorisk volumen på 1 s [FEV1]/forceret vital kapacitet [FVC] ≤0,70) vil blive rekrutteret under deres regelmæssige opfølgning.
2. Kontrolgruppe: alders- og kønsmatchede frivillige uden forudgående diagnose af KOL eller andre respiratoriske tilstande og med post-bronkodilatator forceret ekspiratorisk volumen på 1 s [FEV1]/forceret vitalkapacitet [FVC] >0,70.
3. Forværrede KOL-patienter: Patienter med tidligere KOL-diagnose (40 år eller ældre med baseline post-bronkodilatator forceret ekspiratorisk volumen på 1 s [FEV1]/forceret vitalkapacitet [FVC] ≤0,70) indlagt på hospitalets lungeafdeling på grund af KOL-eksacerbation.

Charlson Comorbidity Index vil blive registreret fra alle deltagere i undersøgelsen. Patienter med akutte eksacerbationer 1 måned før undersøgelsen, patienter inkluderet i pulmonal rehabilitering under undersøgelsen eller 6 måneder før inklusionsperioden, med andre potentielle årsager til sarkopeni (maligne sygdomme, hjertesvigt, hyperthyroidisme eller andre kroniske ødelæggende sygdomme) og patienter med kendte kroniske nyresygdomme eller nylig akut nyreskade vil blive udelukket fra undersøgelsen. Blodprøver og alle andre målinger vil blive foretaget samme dag, som patienter accepterer at deltage i undersøgelsen.

Kliniske karakteristika

Ved optagelsen i studiet vil KOL-patienter blive opdelt i forskellige kategoriske grupper: (1) ikke-symptomatiske patienter (COPD Assessment Test [CAT]-score < 10) versus symptomatiske patienter (CAT-score ≥10), (2) ikke-dyspnøiske patienter (modificeret Medical Research Council dyspnø-score [mMRC] < 2) versus dyspnøiske patienter (mMRC ≥2), høj risiko for eksacerbationspatienter (dem med 2 eller flere eksacerbationer, der kræver behandling med antibiotika eller systemiske steroider eller mindst én hospitalsindlæggelse i den tidligere år) versus lav risiko for eksacerbationspatienter, og (4) tidligere rygere versus aktive rygere. Efter indtræden i undersøgelsen vil der blive taget blodprøver, og patienter vil blive fulgt op i 1 år (et besøg efter 6 måneder og et besøg efter 12 måneder), og eksacerbationer og hospitalsindlæggelser vil blive registreret prospektivt. I løbet af opfølgningsperioden vil alle kliniske efterforskere i undersøgelsen være blinde for mitoquines resultater. I denne periode vil patienter med mulige pulmonale eksacerbationer blive instrueret i at gå frit til sygehusets Akutafdeling, og det team af læger vil frit beslutte at indlægge dem eller ej, i henhold til deres egne kliniske kriterier.

I henhold til mitokinniveauerne vil patienterne blive opdelt i to grupper: en sammensat af dem inden for den højeste kvartil af mitokinerne, og den anden gruppe vil inkludere patienter i de tre andre kvartiler af niveauerne af mitokiner.

Målinger Basal dyspnø vil blive registreret ved hjælp af mMRC dyspnø-skala. CAT-score vil blive registreret ved selvadministreret spørgeskema. Tidligere eksacerbationer vil blive registreret fra kliniske optegnelser fra patienter inkluderet i undersøgelsen. Spirometri vil blive målt i henhold til American Thoracic Society/European Respiratory Society (ATS/ERS) i alle fag.

Kropssammensætning vil blive estimeret af en bioelektrisk impedansenhed (OMROM BF511, Omrom, Japan), og FFMI vil blive beregnet som forholdet mellem FFM og højden i kvadratmetre. 6-minutters gangtesten vil blive udført i henhold til protokollen fra American Thoracic Society: Patienterne blev bedt om at gå så langt som muligt på 6 minutter i en 30 m lige korridor uden nogen afbrydelse. Ved afslutningen af ​​testen vil den distance, patienterne har gået, og dyspnø blive registreret. Humanin og MOTS-c vil blive målt ved ELISA (Mybiosource), FGF21 og GDF15. Vil blive målt ved ELISA (Quantikine). Om muligt vil Romo1 også blive målt ved ELISA. Undersøgelsen vil blive opdelt i 3 besøg: BESØG 1: Blodprøvetagning og kliniske karakteristika. BESØG 2: 6 måneder efter besøg 1: Forværringer og hospitalsindlæggelser (antal og dato) efter besøg 1. BESØG 3: 12 måneder efter besøg 1: Forværringer og hospitalsindlæggelser (antal og dato) efter besøg 2.

Undersøgelsens endepunkter Primært endepunkt: Mitoquiner kan bruges til at estimere risikoen for hospitalsindlæggelse hos KOL-patienter.

Sekundære endepunkter:

1. -Mitoquiner kan bruges til at estimere KOL-eksacerbationsrisikoen hos KOL-patienter.
2. - Mitokiner er ændret hos KOL-patienter.
3. - Mitoquiner ændres ved KOL-eksacerbationer.
4. - Mitokiner korrelerer med forskellige KOL-variable (FEV1, FFMI..).

Statistisk plan eller dataanalyse Data vil blive præsenteret som middelværdi ± SD for normalfordelte data eller median (interkvartilområde) for ikke-parametriske data. Forskelle mellem grupper vil blive analyseret ved hjælp af uparrede t-tests for parametriske data eller Mann-Whitney-tests for ikke-parametriske data.

Korrelationer mellem datasæt blev undersøgt ved hjælp af Pearson (r) korrelationskoefficienten for parametriske data eller Spearman rank (rs) korrelationskoefficienten for ikke-parametriske data. Normal fordeling vil blive testet ved hjælp af en Kolmogorov-Smirnov test.

Kaplan-Meier estimater vil blive brugt til at beregne andelen af ​​deltagere, der har et arrangement over tid. Univariat og multivariat analyse ved hjælp af Cox proportional risikoanalyse vil blive udført ved brug af SPSS Software version 25.00 til PC for at analysere udviklingen af ​​de første hændelser i henhold til basale niveauer af mitokiner og for at identificere risikofaktorer forbundet med eksacerbationer og hospitalsindlæggelse. Forskelle vil blive betragtet som signifikante, hvis p-værdier var mindre end 0,05. Alle rapporterede p-værdier vil være tosidede.

Begrænsninger og etiske overvejelser Dette er et enkelt-center studie, og det skal derfor gentages i multicentriske undersøgelser, hvor der anvendes et højere antal patienter fra forskellige lande. Selvom det er dyrt og kompliceret, kunne nogle teknikker såsom muskelbiopsi, ergometri, muskelmasse kvantificeret ved hjælp af CT eller shuttle-test udføres for at få et bedre overblik over muskelmasse og funktion hos disse patienter.

Der forventes ingen potentiel skade for patienter af denne undersøgelse. Denne undersøgelse blev godkendt af Cantabria etikkomité (Kode: :2018.276). Selvom undersøgelsen er finansieret af firmaet GlaxoSmithKline (GSK), er det en uafhængig undersøgelse, og efterforskerne modtager ingen økonomisk kompensation.