Mitokinek COPD-ben

BEVEZETÉS A krónikus obstruktív tüdőbetegséget (COPD) a légutak progresszív és alig visszafordítható elzáródása jellemzi, amely alapvetően a kis légutakat érinti (krónikus obstruktív bronchiolitis), amely változóan társul a tüdőparenchyma pusztulásával (emphysema). A 45 év felettiek 10%-a szenved COPD-ben. A COPD várhatóan 2020-ra a harmadik vezető halálok lesz a világon. A COPD vezető oka a nyugati országokban a krónikus dohányfüst érintkezés a légutakkal, számos mérgező anyag és reaktív oxigénfajták (ROS) tömeges bejutása a szervezetbe, amelyek oxidatív stresszt (OS) váltanak ki. A COPD-ben az OS exogén (ROS belélegzés) és endogén (dohánymérgező anyagok és a saját betegség által kiváltott ROS). Egyes kutatók úgy vélik, hogy a COPD-ben az OS szorosan összefügg a felgyorsult sejtöregedés sajátos típusával, amely krónikus gyulladásos folyamathoz kapcsolódik, amely nemcsak a légzőrendszert érinti, hanem a test számos más részét is (vázizom, szív- és érrendszer, globális anyagcsere) , immunrendszer stb.).

A mitokondriális diszfunkció központi, de nem kizárólagos szerepet játszik az oxidatív stresszben, a sejtek öregedésében és a krónikus gyulladásban. Ezért a COPD hátterében álló mitokondriális diszfunkció jobb megértése lehetővé tenné a fiziopatológia jobb megértését és új lehetséges terápiás célpontok azonosítását. A COPD mitokondriális elváltozásai a bronchopulmonalis, izom- és immunológiai területeken mind morfológiai, mind patofiziológiai szempontból széles körben dokumentáltak. A mitokondriális diszfunkció lehet elsődleges (veleszületett) vagy másodlagos (szerzett, mint a dohányzás esetében). Ez egy tág fogalom, beleértve a károsodott sejtenergia-termelést, a ROS vagy a Krebs-ciklus egyes metabolitjainak túlzott termelődését a mitokondriumokban, valamint az alapvető mitokondriális komponensek minőségellenőrzésének elvesztését, ami végül az intramitokondriális molekulák abnormális kibocsátásához vezet (mtDNS, ATP, citokróm c, Romo1 stb.) a citoszolba és az extracelluláris folyadékokba. Ezen molekulák némelyike ​​DAMP-ként (károsodáshoz kapcsolódó molekuláris minták) viselkedik, és a veleszületett immunitás aktiválását, ezáltal gyulladást vált ki. A citokróm C és a Romo1 vérszintjét az oxidatív stressz markereiként javasolták. A mitokondriumok fő funkciója az ATP, az élő sejt fenntartásához szükséges alapvető energiahordozó molekula létrehozása. Az ATP-termelés a mitokondriumokban lévő egyéb energia-prekurzorokból az elektrontranszport lánchoz (OXPHOS/ETC) kapcsolódó oxidatív foszforilációs rendszeren keresztül történik. Ezek az organellumok alapvető szerepet játszanak 1) a szénhidrátok, lipidek és fehérjék specifikus metabolitjainak létrehozásában, amelyek számos sejtfunkcióhoz nélkülözhetetlenek, 2) a hemek és szteroid hormonok szintézisében, 3) a "klaszterek" kezelésében. Fe és S, 4) az intracelluláris kalcium celluláris homeosztázisa, 5) a veleszületett és szerzett immunválasz, valamint 6) az apoptózis bizonyos típusainak szabályozása.

A sejtek folyamatosan reagálnak azokra a környezeti változásokra, amelyeknek ki vannak téve. Sejtes stresszhelyzetekben (pl. kalóriahiány, specifikus tápanyagok hiánya, hőmérsékletváltozás, stb.) a sejtmag úgy reagál, hogy jeleket küld a mitokondriumoknak, így azok módosítják funkciójukat, hogy alkalmazkodjanak a változáshoz (anterográd jelátvitel a sejtmagból a mitokondriumokba: például a fizikai gyakorlat igénybe veszi ATP az izomsejtben, amely aktiválja az AMPK-t, amely aktiválja a PGC-1alpha nukleáris transzkripciós kofaktort, ami viszont aktiválja az OXPOS/ETC-t és a mitokondriális biogenezist). Másrészt, ha magukban a mitokondriumokban stresszhelyzet van (pl. oxigén szabad gyökök túlzott termelése, kibontott intramitokondriális fehérjék stb.) jeleket küldenek a sejtmagnak, hogy módosítsa a mitokondriális károsodás megelőzésére/korrekciójára szolgáló fehérjék termelését, beleértve a chaperonokat, antioxidánsokat vagy proteolitikus enzimeket, proteolitikus (autonóm vagy intracelluláris retrográd jelátvitel) .

A mitokondriumokról a közelmúltban kimutatták, hogy képesek közvetlenül vagy közvetve olyan peptideket generálni, amelyek nemcsak az őket termelő saját sejtet befolyásolják, hanem távolsági hatásuk is van (nem autonóm vagy extracelluláris retrográd jelátvitel). Ezeket az anyagokat, amelyeket Dillin csoportja fedezett fel, mitokineknek neveznek, és jeleket küldenek a stresszes mitokondriumokkal rendelkező szövetekből az egész szervezetbe, mivel olyan hormonok, amelyek felkészítik az egész szervezetet a celluláris stresszre, amelynek ki lesz téve.

A mitokinok felszabadulnak bármilyen mitokondriális stressz esetén (veleszületett vagy szerzett mutációk az mtDNS-ben, az OXPHOS/ETC rendellenességei, amelyek oxidatív stresszt okoznak, mitokondriális toxinok stb.). Emlősökben a mitokondriális stressz általában a stresszre adott úgynevezett integrált celluláris válaszhoz (ICRS) társul." Az ICRS egyik legfontosabb mechanizmusa az UPR (Unfolded protein response), amelyben a mitokondriumok összehangoltan vesznek részt az endoplazmatikus retikulum rendszerrel és a sejtmaggal.

Legalább két különböző típusú mitokin létezik: 1) a mitokondriális DNS-ben (mtDNS) kódolt primer mitokinek és 2) a sejtmag DNS-ben (nDNS) kódolt másodlagos mitokinek, amelyek szekrécióját a stresszes mitokondriumokból a nDNS (pl. ATF4 stb.). A humanin (HN), a MOTS-c (Mitochondrial ORF of the Tiwelve S-c) és hat, a humaninhoz hasonló peptid (SHLP-k 1-6) elsődleges mitokinnek számítanak, bár számuk magasabb is lehet. Egészen a közelmúltig úgy gondolták, hogy a mitokondriális DNS csak 37 gént kódol (13 peptid, kizárólag a mitokondriumokban találhatók, mindegyik az ETC alegységei, 22 transzfer RNS -tRNS- és 2 riboszómális RNS -rRNS-) RNS-t. Ma már tudjuk, hogy a 16s és 12s rRNS sORF-eket ("rövid nyitott leolvasási kereteket") tartalmaz, amelyek 20-30 aminosavból fordítják le a szekréciós peptideket. Nem ismert, hogy milyen bensőséges mechanizmusok szabályozzák ezeknek a mitokineknek a szintézisét és felszabadulását, bár lehetséges, hogy a mitokondriális riboszomális aktivációhoz kapcsolódnak. Az ATF4 aktiválása alatt álló másodlagos mitokinek (amelyek a sejtmag DNS-ben kódolódnak) tekintetében ismerjük a 21-es fibroblaszt növekedési faktort (FGF21), a 15-ös növekedési és fejlődési faktort (MIC1/GDF15), a follistatint és az intermedin-adrenomedullint2. Ezek a mitokinek más ingerekre is reagálnak, függetlenül a mitokondriumoktól.

A humanin egy 21 vagy 24 aminosavból álló peptid, amely többféle citoprotektív funkcióval rendelkezik a mitokondriális károsodás ellen (4 kibontott fehérjéhez növeli az antioxidánsok és chaperonok szintézisét). Gyulladáscsökkentő (csökkenti a gyulladásos citokinek és növeli a gyulladáscsökkentő citokinek szintjét) és antiapoptotikus (blokkolja az apoptotikus faktorokat, mint például a Bak és az IGFBP3), legalább 2 membránreceptor révén és számos kölcsönhatásban más intracelluláris és extracelluláris fehérjékkel, számos szövetben. (idegrendszer, máj, szív, érfal, vázizom, retina pigmenthám, ivarmirigyek stb.). Jótékony anyagcsere hatásai is vannak (centrális szinten csökkenti az inzulinrezisztenciát, védi a hasnyálmirigy béta-sejtjét az oxidatív stressztől és negatív visszacsatolása van az IGF1-gyel). A közelmúltban bebizonyosodott, hogy azoknál az embereknél, akiknél ez a hormon magas szintje van, az életkor előrehaladtával kevésbé romlik a kognitív képessége, és nagyon hosszú életűek is.

A MOTS-c egy másik kisméretű, 16 aminosavból álló, mtDNS-t kódoló, de kizárólag a citoszolikus riboszómákban szintetizálódó peptid, amely jótékony antioxidáns és metabolikus hatással is rendelkezik, mivel csökkenti az inzulinrezisztenciát és megelőzi az elhízást. Másrészt növeli egyes fertőzésekkel szembeni ellenálló képességét, növeli és csökkenti a csontfelszívódást, így csontritkulás ellenes hatása is lehet. Mindkét hormon mérhető a vérben ELISA-val, bár vannak bizonyos eltérések a plazmaszintjükben az alkalmazott teszttől függően.

Az FGF21 egy jól jellemzett hormon, amely serkenti a zsírsavak ketogenezist és béta-oxidációját. Kiválasztását az éhezés és a PPAR-α receptorok aktiválása szabályozza, de az is ismert, hogy minden olyan mitokondriális stresszhelyzetben megemelkedik, amely aktiválja a mitokondrium-nukleusz jeleket. A MIC1/GDF15 egy másik keringő hormon, amely csökkenti az éhséget, aktiválva egy specifikus receptor szintet (GFRAL), amely a postrema területen és a szoliter traktus magjában található. A GDF15 emelkedett szintjét rákos cachexiában és sok más helyzetben találták, köztük a COPD-ben. Akkor is felszabadul, amikor a mitokondriális-nukleusz jelek aktiválódnak. COPD-ben az itt áttekintett összes mitokin közül csak a GDF15 vérszintről van információ, a többi mitokin szintjéről azonban nincs adat a szakirodalomban. A COPD előrehaladtával a mitokinok vérszintje valószínűleg fokozatosan emelkedik, ami a mitokondriális funkció további romlását fejezi ki, bár szintjük csak egy bizonyos szintig emelkedhet, majd csökkenhet, ha a mitokondriális károsodás elviselhetetlen, így egyfajta mitohormetikus választ jelent. HIPOTÉZIS A mitokondriális diszfunkció összefüggésében kifejeződő mitokinek COPD-s betegekben megváltoznak, és a legrosszabb klinikai kimenetelekkel járnak. Ezenkívül a mitokinek prognosztikai faktorként és potenciális terápiás célpontként használhatók COPD-ben. CÉLKITŰZÉSEK

1. - A mitokinszintek leírása egy kontrollcsoportban, egy stabil COPD-s ambuláns csoportban és egy csoportban súlyosbodott COPD-ben.
2. - A COPD-betegek különböző csoportjaiban a félhangszintek közötti különbségek leírása (különböző szintű obstrukció, magas exacerbáció kockázatú betegek vs. exacerbáció kockázata nélkül, CAT-pontszám <10 vs a többi beteg, alacsony zsírtartalmú betegek Tömegindex (FFMI) a betegek többi részéhez viszonyítva).
3. -A félhangok és a különböző klinikai eredmények, például az FFMI, a megtett távolság 6 perces séta tesztben, a FEV1, a CAT pontszám közötti összefüggés értékelése.
4. - Annak értékelése, hogy a mitokinok felhasználhatók-e az exacerbáció és a kórházi felvétel jövőbeli kockázatának előrejelzésére.

MÓD

Vizsgálati populáció

Bevételi és kizárási kritériumok:

Stabil COPD-s betegek: a Kórház Pneumológiai ambulanciái közül kerülnek kiválasztásra

Universitario Marqués de Valdecilla. A COPD-s betegeknek meg kell felelniük a következő kritériumoknak:

40 éves vagy idősebb, a kiindulási hörgőtágító kényszerített kilégzési térfogat 1 s alatt [FEV1]/erőltetett vitálkapacitás [FVC] ≤0,70.

Súlyos COPD-s betegek: a Hospital Universitario Marqués de Valdecilla kórházban COPD exacerbáció diagnózisával felvett betegek közül választják ki.

Kontroll csoport: COPD-ben vagy más akut vagy krónikus légúti betegségben nem szenvedő betegektől és a betegek hozzátartozóitól származnak.

A 0,05-ös alfa-kockázat és a 0,2-es béta-kockázat elfogadása a kétoldalú tesztben az első csoportban 30, a másodikban 90 alany szükséges ahhoz, hogy statisztikailag szignifikáns aránybeli különbséget találjunk, amely várhatóan 0,45 az 1. csoportban és 0,1 a 2. csoportban. 5%-os lemorzsolódásra számítva. Az ARCSINUS közelítés. Ezt a számítást csoportunk által korábban publikált tanulmányok alapján végeztük. Egyszerűen számolunk 120 COPD-s betegből, 30 COPD exacerbációban szenvedő betegből és 30 kontrollból.

Cél beiratkozás/mintanagyság 180 Várható felvételi arány 25 beteg havonta A vizsgálat kezdetének becsült dátuma: A Biobankban gyűjtött minták 2019.12.01-től A mintákat biokémiai laborba küldték 2020.03.01 A tanulmány befejezésének becsült időpontja: (a nyomon követés vége) 2021.04.05. Tanulmánytervezés és módszerek Megfigyelési prospektív tanulmány. A betegeket a COPD ambulanciákról, a dohányzásról leszokást segítő ambulanciákról, valamint a COPD súlyosbodása miatt kórházba került betegekről toborozzák. Minden beteg írásos beleegyezést kap a részvételhez. Ezt a tanulmányt a Cantabria Etikai Bizottsága (CEIC) már jóváhagyta.

Résztvevők

1. A stabil COPD-s betegeket (40 éves vagy idősebb, a hörgőtágító utáni kényszerkilégzési térfogat 1 s alatt [FEV1]/forced vital kapacitás [FVC] ≤0,70) a rendszeres nyomon követés során toborozzák.
2. Kontroll csoport: életkorban és nemben egyező önkéntesek, akiknél nem diagnosztizáltak COPD-t vagy egyéb légúti betegségeket, és hörgőtágító utáni kényszerkilégzési térfogattal 1 s alatt [FEV1]/forced vital kapacitás [FVC] >0,70.
3. Exacerbált COPD-s betegek: COPD-vel korábban diagnosztizált betegek (40 éves vagy idősebb, hörgőtágító utáni kényszerkilégzési térfogat 1 s alatt [FEV1]/forced vital kapacitás [FVC] ≤0,70), COPD exacerbációja miatt kórházi pulmonológiai osztályra kerültek.

A Charlson komorbiditási indexet a vizsgálatban részt vevő összes résztvevőtől rögzítik. A vizsgálat előtt 1 hónappal akut exacerbációban szenvedő betegek, a vizsgálat alatt vagy 6 hónappal a felvételi időszak előtt tüdőrehabilitációban részt vevő betegek, akiknél a szarkopénia egyéb lehetséges okai (rosszindulatú betegségek, szívelégtelenség, pajzsmirigy-túlműködés vagy egyéb krónikus pusztító betegségek) szenvednek. ismert krónikus vesebetegségek vagy közelmúltbeli akut vesekárosodás kizárásra kerülnek a vizsgálatból. A vérmintákat és minden egyéb mérést ugyanazon a napon kell elvégezni, amikor a betegek elfogadják a vizsgálatba való belépést.

Klinikai jellemzők

A vizsgálatba való felvételkor a COPD-s betegeket különböző kategóriákba sorolják: (1) nem tünetmentes betegek (COPD Assessment Test [CAT] pontszám < 10) szemben a tünetekkel járó betegekkel (CAT pontszám ≥10), (2) nem dyspniás betegek (módosított Medical Research Council dyspnea score [mMRC] < 2) szemben a nehézlégzéssel küzdő betegekkel (mMRC ≥2), nagy az exacerbáció kockázata (azok, akiknél 2 vagy több exacerbáció esetén antibiotikus vagy szisztémás szteroid kezelést, vagy legalább egy kórházi felvételt igényelnek az előző időszakban év) szemben az exacerbáció alacsony kockázatával, és (4) a korábbi dohányosokkal szemben az aktív dohányzókkal szemben. A vizsgálatba való belépés után vérmintákat vesznek, és a betegeket 1 évig követik (egy vizit 6 hónap után és egy vizit 12 hónap után), és prospektíven rögzítik az exacerbációkat és a kórházi felvételeket. A követési időszak alatt a vizsgálatban részt vevő összes klinikai vizsgálót nem látják a mitokinek eredményei. Ezen időszak alatt az esetleges tüdőexacerbációban szenvedő betegeket arra utasítják, hogy szabadon menjenek a Kórház Sürgősségi Osztályára, és az orvosok csoportja szabadon dönthet arról, hogy kórházba helyezik-e őket, saját klinikai kritériumaiknak megfelelően.

A mitokinek szintje szerint a betegek két csoportra oszthatók: az egyik a mitokinek legmagasabb kvartilisébe tartozók, a másik csoportba pedig a mitokinszintek másik három kvartilisében lévők tartoznak.

Mérések A bazális nehézlégzést az mMRC dyspnoe skála segítségével rögzítjük. A CAT pontszámot önkitöltős kérdőívvel rögzítjük. A korábbi exacerbációkat a vizsgálatban részt vevő betegek klinikai feljegyzései alapján rögzítik. A spirometriát az American Thoracic Society/European Respiratory Society (ATS/ERS) szerint minden alanyban mérik.

A testösszetételt egy bioelektromos impedanciaeszközzel (OMROM BF511, Omrom, Japán) becsülik meg, és az FFMI-t az FFM és a méterben megadott magasság négyzetének arányaként számítják ki. A 6 perces sétatesztet az American Thoracic Society protokollja szerint végzik el: a betegeket arra kérték, hogy 6 perc alatt, megszakítás nélkül, 30 méteres egyenes folyosón sétáljanak minél többet. A teszt végén rögzítjük a betegek által megtett távolságot és a nehézlégzést. A humanint és a MOTS-c-t ELISA-val (Mybiosource), FGF21-vel és GDF15-tel mérjük. ELISA-val (Quantikine) mérjük. Lehetőség szerint a Romo1-et ELISA-val is mérjük. A vizsgálat 3 látogatásra oszlik: 1. LÁTOGATÁS: Vérmintavétel és klinikai jellemzők. 2. LÁTOGATÁS: 6 hónappal az 1. látogatás után: Exacerbációk és kórházi felvételek (szám és dátum) az 1. vizit után. 3. LÁTOGATÁS: 12 hónappal az 1. vizit után: Exacerbációk és kórházi felvételek (szám és dátum) a 2. vizit után.

A vizsgálat végpontjai Elsődleges végpont: A mitokinek a COPD-s betegek kórházi felvételi kockázatának becslésére használhatók.

Másodlagos végpontok:

1. -A mitokinek felhasználhatók a COPD súlyosbodási kockázatának becslésére COPD-s betegeknél.
2. - COPD-s betegekben a mitokinek megváltoztak.
3. - COPD exacerbáció esetén a mitokinek megváltoznak.
4. - A mitokinek különböző COPD-változókkal korrelálnak (FEV1, FFMI...).

Statisztikai terv vagy adatelemzés Az adatok átlagos eloszlású adatok esetén átlag ± SD, nem paraméteres adatok esetén medián (interkvartilis tartomány) formájában jelennek meg. A csoportok közötti különbségeket a paraméteres adatokhoz párosítatlan t-próbákkal, a nem paraméteres adatokhoz Mann-Whitney-tesztekkel elemezzük.

Az adatsorok közötti összefüggéseket a paraméteres adatok Pearson (r) korrelációs együtthatójával, a nem paraméteres adatok esetében a Spearman rang (rs) korrelációs együtthatóval vizsgáltuk. A normál eloszlást Kolmogorov-Smirnov teszttel teszteljük.

A Kaplan-Meier becslések alapján számítják ki azon résztvevők arányát, akiknek idővel eseménye van. A Cox arányos kockázatelemzést alkalmazó egy- és többváltozós elemzést az SPSS Software 25.00 for PC-vel végezzük el, hogy elemezzük az első események alakulását a mitokinek alapszintje szerint, és azonosítsuk az exacerbációkkal és kórházi kezeléssel kapcsolatos kockázati tényezőket. A különbségek akkor tekinthetők szignifikánsnak, ha a p-értékek kisebbek, mint 0,05. Minden jelentett p érték kétoldalas lesz.

Korlátozások és etikai megfontolások Ez egy egyközpontú vizsgálat, ezért multicentrikus vizsgálatokban kell megismételni, több különböző országból érkező beteg bevonásával. Bár drágák és bonyolultak, néhány technikát, például izombiopsziát, ergometriát, CT-vel vagy shuttle-teszttel számszerűsített izomtömeg mérést el lehet végezni annak érdekében, hogy jobb áttekintést kapjunk ezeknél a betegeknél az izomtömegről és -funkcióról.

Ettől a vizsgálattól nem várható, hogy károsítsák a betegeket. Ezt a tanulmányt a Cantabria etikai bizottság hagyta jóvá (Kód: :2018.276). Bár a tanulmányt a GlaxoSmithKline (GSK) cég finanszírozza, ez egy független tanulmány, és a nyomozók nem kapnak anyagi ellentételezést.