Mitokiinit COPD:ssä

JOHDANTO Krooniselle obstruktiiviselle keuhkosairaudelle (COPD) on tyypillistä etenevä ja tuskin palautuva hengitysteiden tukos, joka vaikuttaa pääasiassa pieniin hengitysteihin (krooninen obstruktiivinen keuhkoputkentulehdus), joka liittyy vaihtelevasti keuhkoparenkyyman (emfyseeman) tuhoutumiseen. 10 prosentilla yli 45-vuotiaista on keuhkoahtaumatauti. COPD:n odotetaan olevan maailman kolmanneksi yleisin kuolinsyy vuoteen 2020 mennessä. Länsimaiden keuhkoahtaumatautien yleisin syy on krooninen tupakansavun kosketus hengitysteihin, jolloin kehoon pääsee massiivisesti monia myrkyllisiä aineita ja reaktiivisia happilajeja (ROS), jotka aiheuttavat oksidatiivista stressiä (OS). Keuhkoahtaumatauti on sekä eksogeeninen (hengitetty ROS) että endogeeninen (tupakkamyrkyjen ja oman taudin aiheuttama ROS). Jotkut tutkijat katsovat, että keuhkoahtaumatautiin liittyvä OS liittyy läheisesti erikoistyyppiseen kiihtyneeseen solujen vanhenemiseen, joka liittyy krooniseen tulehdusprosessiin, joka ei vaikuta vain hengityselimiin, vaan myös moniin muihin kehon osiin (luurankolihas, sydän- ja verisuonijärjestelmä, globaali aineenvaihdunta). , immunologinen järjestelmä jne.).

Mitokondrioiden toimintahäiriöllä on keskeinen, mutta ei yksinomainen, rooli oksidatiivisessa stressissä, solujen vanhenemisessa ja kroonisessa tulehduksessa. Siksi keuhkoahtaumataudin taustalla olevan mitokondrioiden toimintahäiriön parempi ymmärtäminen mahdollistaisi fysiopatologian paremman ymmärtämisen ja uusien mahdollisten terapeuttisten kohteiden tunnistamisen. Keuhkoahtaumatautien mitokondriaaliset muutokset bronkopulmonaalisilla, lihaksilla ja immunologisilla alueilla on dokumentoitu laajasti sekä morfologisesti että patofysiologisesti. Mitokondrioiden toimintahäiriö voi olla primaarinen (synnynnäinen) tai toissijainen (hankittu, kuten tupakoinnin tapauksessa). Se on laaja käsite, joka sisältää solujen energiantuotannon heikkenemisen, ROS:n tai joidenkin Krebsin syklin metaboliittien liiallisen muodostumisen mitokondrioissa ja mitokondrioiden olennaisten komponenttien laadunvalvonnan menettämisen, mikä lopulta johtaa epänormaaliin intramitokondriaalisten molekyylien (mtDNA, ATP, sytokromi c, Romo1 jne.) sytosoliin ja solunulkoisiin nesteisiin. Jotkut näistä molekyyleistä käyttäytyvät kuten DAMP:t (vaurioon liittyvät molekyylimallit) ja indusoivat synnynnäisen immuniteetin aktivoitumista ja siten tulehdusta. Sytokromi C:n ja Romo1:n pitoisuuksia veressä on ehdotettu oksidatiivisen stressin merkkiaineiksi. Mitokondrioiden päätehtävä on tuottaa ATP:tä, joka on perusenergiaa kuljettava molekyyli elävän solun ylläpitämiseksi. ATP:tä tuotetaan muista mitokondrioiden energiaprekursoreista oksidatiivisen fosforylaatiojärjestelmän kautta, joka on kytketty elektroninkuljetusketjuun (OXPHOS/ETC). Näillä organelleilla on myös perustavanlaatuinen rooli 1) hiilihydraattien, lipidien ja proteiinien spesifisten metaboliittien tuottamisessa, jotka ovat välttämättömiä useille solutoiminnoille, 2) heemien ja steroidihormonien synteesissä, 3) solujen "klusterien" hallinnassa. Fe ja S, 4) solunsisäisen kalsiumin homeostaasi, 5) immuunivaste, sekä synnynnäinen että hankittu, ja 6) joidenkin tyyppisten apoptoosien säätely.

Solut reagoivat jatkuvasti ympäristön muutoksiin, joille ne ovat alttiina. Solujen stressitilanteissa (esim. kalorivaje, tiettyjen ravintoaineiden puute, lämpötilan muutokset jne.) solun ydin reagoi lähettämällä signaaleja mitokondrioihin niin, että ne muokkaavat toimintaansa sopeutuakseen muutokseen (anterogradinen signalointi ytimestä mitokondrioihin: esimerkiksi liikunta kuluttaa ATP lihassolussa, joka aktivoi AMPK:n, joka aktivoi tuman transkriptiokofaktorin PGC-1alpha, joka puolestaan ​​aktivoi OXPOS/ETC:tä ja mitokondrioiden biogeneesiä). Toisaalta, kun itse mitokondrioissa on stressaava tilanne (esim. happivapaiden radikaalien liiallinen tuotanto, laskostumattomat intramitokondriaaliset proteiinit jne.) ytimeen lähetetään signaaleja, jotta se muokkaa mitokondrioiden vaurioiden estämiseen/korjaamiseen tarkoitettujen proteiinien tuotantoa, mukaan lukien kaperonit, antioksidantit tai proteolyyttiset entsyymit proteolyyttiset (autonominen tai solunsisäinen retrogradinen signalointi) .

Mitokondrioiden on äskettäin osoitettu pystyvän tuottamaan suoraan tai epäsuorasti peptidejä, jotka eivät vain vaikuta niitä tuottavaan omaan soluun, vaan niillä on etäisyysvaikutuksia (ei-autonominen tai solunulkoinen retrogradinen signalointi). Näitä Dillinin ryhmän löytämiä aineita kutsutaan mitokiineiksi ja ne lähettävät signaaleja stressaantuneista mitokondrioista kudoksista koko kehoon, koska ne ovat hormoneja, jotka valmistelevat koko organismia reagoimaan siihen solustressiin, jolle se tulee altistumaan.

Mitokiinit vapautuvat, kun esiintyy minkäänlaista mitokondrioiden stressiä (synnynnäiset tai hankitut mutaatiot mtDNA:ssa, OXPHOS/ETC:n häiriöt, jotka aiheuttavat oksidatiivista stressiä, mitokondriotoksiinit jne.). Nisäkkäillä mitokondriaalinen stressi liittyy yleensä niin kutsuttuun integroituun soluvasteeseen stressiin (ICRS)". Yksi ICRS:n tärkeimmistä mekanismeista on UPR (Unfolded protein response), johon mitokondriot osallistuvat koordinoidusti endoplasmisen verkkokalvojärjestelmän ja solun ytimen kanssa.

Mitokiinejä on ainakin kahta eri tyyppiä: 1) primaariset mitokiinit, jotka koodataan mitokondrion DNA:han (mtDNA) ja 2) sekundaariset mytokiinit, jotka on koodattu tuman DNA:ssa (nDNA), joiden eritystä säätelevät aktivaatiosignaalit stressaantuneista mitokondrioista nDNA (esim. ATF4 jne). Humaniinia (HN), MOTS-c:tä (kahdentoista S-c:n mitokondriaalinen ORF) ja kuutta humaniinin kaltaista peptidiä (SHLP:t 1-6) pidetään primäärisinä mitokiineina, vaikka määrä voi olla suurempi. Viime aikoihin asti ajateltiin, että mitokondrio-DNA koodaa vain 37 geeniä (13 peptidiä löydettiin yksinomaan mitokondrioista, ne kaikki ovat ETC:n alayksiköitä, 22 siirto-RNA:ta -tRNA- ja 2 ribosomaalista RNA:ta -rRNA-) RNA:ta. Tiedämme nyt, että 16s ja 12s rRNA sisältävät sORF:itä ("lyhyet avoimet lukukehykset"), jotka kääntävät erittäviä peptidejä 20-30 aminohaposta. Ei tiedetä, mitkä intiimit mekanismit säätelevät näiden mitokiinien synteesiä ja vapautumista, vaikka on mahdollista, että ne liittyvät mitokondrioiden ribosomaaliseen aktivaatioon. Mitä tulee sekundaarisiin mitokiiniin (tuman DNA:han koodaaviin) ATF4:n aktivoitumisen alaisena tunnemme fibroblastisen kasvutekijän 21 (FGF21), kasvu- ja kehitystekijän 15 (MIC1/GDF15), follistatiinin ja intermediini-adrenomedulliinin2. Nämä mitokiinit reagoivat myös muihin ärsykkeisiin mitokondrioista riippumatta.

Humaniini on 21 tai 24 aa:n peptidi, jolla on useita sytoprotektiivisia toimintoja mitokondriovaurioita vastaan ​​(lisää antioksidanttien ja kaperonien synteesiä neljälle laskostumattomalle proteiinille). Se on anti-inflammatorinen (alentaa tulehdussytokiinien määrää ja nostaa anti-inflammatoristen sytokiinien määrää) ja antiapoptoottinen (salpaa apoptoottisia tekijöitä, kuten Bak ja IGFBP3) ainakin kahden kalvoreseptorin ja useiden vuorovaikutusten kautta muiden solunsisäisten ja solunulkoisten proteiinien kanssa monissa kudoksissa. (hermosto, maksa, sydän, verisuoniseinä, luustolihakset, verkkokalvon pigmenttiepiteeli, sukurauhaset jne.). Sillä on myös hyödyllisiä metabolisia vaikutuksia (vähentää insuliiniresistenssiä keskustasolla, suojaa haiman beetasolua oksidatiiviselta stressiltä ja sillä on negatiivinen palaute IGF1:n kanssa). Äskettäin on todistettu, että ihmisillä, joilla on korkea tämän hormonin taso, on vähemmän kognitiivisia häiriöitä iän myötä ja he ovat myös erittäin pitkäikäisiä.

MOTS-c on toinen pieni 16 aminohapon peptidi, jota koodaa mtDNA, mutta syntetisoituu yksinomaan sytosolisissa ribosomeissa, ja jolla on myös hyödyllisiä antioksidanttisia ja metabolisia vaikutuksia, koska se vähentää insuliiniresistenssiä ja ehkäisee liikalihavuutta. Toisaalta se lisää vastustuskykyä joitain infektioita vastaan ​​lisää ja vähentää luun resorptiota, joten sillä voi olla osteoporoottisia vaikutuksia. Molemmat hormonit ovat mitattavissa verestä ELISA:lla, vaikka niiden plasmatasoissa on tiettyjä eroja käytetystä testistä riippuen.

FGF21 on hyvin karakterisoitu hormoni, joka stimuloi rasvahappojen ketogeneesiä ja beetahapetusta. Sen erittymistä säätelee paasto ja PPAR-α-reseptorien aktivaatio, mutta tiedetään myös sen lisääntyvän missä tahansa mitokondrio-stressitilanteessa, joka aktivoi mitokondrioista tumaan signaaleja. MIC1/GDF15 on toinen verenkierrossa oleva hormoni, joka vähentää näläntunnetta ja aktivoi spesifisen reseptoritason (GFRAL), joka löytyy postrema-alueelta ja yksinäisen alueen ytimestä. Kohonneita GDF15-tasoja on havaittu syöpäkakeksiassa ja monissa muissa tilanteissa, mukaan lukien COPD. Se vapautuu myös, kun mitokondrioiden ja ytimien väliset signaalit aktivoituvat. Keuhkoahtaumataudissa kaikista tässä tarkasteltavista mitokiineista on tietoa vain GDF15-veren tasoista, mutta kirjallisuudessa ei ole tietoa muiden mitokiinien tasoista. Keuhkoahtaumataudin edetessä mitokiinien pitoisuudet veressä todennäköisesti nousevat progressiivisesti, mikä ilmaisee mitokondrioiden toiminnan heikkenemistä entisestään, vaikka niiden tasot voivat nousta vain tietylle tasolle ja sitten laskea, kun mitokondriovaurio on sietämätöntä, mikä muodostaa eräänlaisen mitohormeettisen vasteen. HYPOTEESI Mitokiinit, jotka ilmenevät mitokondrioiden toimintahäiriön yhteydessä, muuttuvat keuhkoahtaumatautipotilailla ja liittyvät pahimpiin kliinisiin tuloksiin. Lisäksi mitokiinejä voidaan käyttää prognostisina tekijöinä ja mahdollisina terapeuttisina kohteina COPD:ssä. TAVOITTEET

1. - Kuvaa mitokiinitasoja kontrolliryhmässä, stabiilien keuhkoahtaumatautipotilaiden ryhmässä ja pahentuneiden COPD-potilaiden ryhmässä.
2. - Kuvaamaan eroja puolisäveltasoissa keuhkoahtaumatautipotilaiden eri ryhmissä (eritasoiset tukkeumat, potilaat, joilla on suuri pahenemisriski vs. ei pahenemisriskiä, ​​potilaat, joiden CAT-pistemäärä on < 10, vs. muut potilaat, potilaat, joilla on vähän rasvaa. Massaindeksi (FFMI) vs. muut potilaat).
3. - Arvioida korrelaatiota puolisävelten ja erilaisten kliinisten tulosten, kuten FFMI:n, kävelymatkan 6 minuutin kävelytestissä, FEV1:n, CAT-pisteiden välillä.
4. - Arvioida, voidaanko mitokiinien avulla ennustaa tulevaa pahenemisriskiä ja sairaalahoitoa.

MENETELMÄT

Tutkimuspopulaatio

Sisällys- ja poissulkemiskriteerit:

Stabiilit COPD-potilaat: valitaan sairaalan pneumologian poliklinikoista

Universitario Marqués de Valdecilla. COPD-potilaiden on täytettävä seuraavat kriteerit:

40-vuotiaat tai vanhemmat, joiden lähtötilanteessa keuhkoputkia laajentavan pakotetun uloshengityksen tilavuus 1 sekunnissa [FEV1]/pakotettu vitaalikapasiteetti [FVC] ≤0,70.

Pahenevat keuhkoahtaumatautipotilaat: Valitaan potilaista, jotka on otettu Hospital Universitario Marqués de Valdecilla -sairaalaan ja joilla on diagnosoitu COPD:n paheneminen.

Kontrolliryhmä: saadaan potilailta, joilla ei ole keuhkoahtaumatautia tai muita akuutteja tai kroonisia hengitystiesairauksia, sekä potilaiden sukulaisilta.

Alfariskin 0,05 ja beetariskin 0,2 hyväksyminen kaksipuolisessa testissä tarvitaan 30 koehenkilöä ensimmäisessä ryhmässä ja 90 toisessa, jotta saadaan tilastollisesti merkitsevä ero, jonka odotetaan olevan 0,45 ryhmässä 1 ja 0,1 ryhmässä 2 Ennakoi 5 prosentin keskeyttämisprosenttia. ARCSINUS-likiarvo. Tämä laskelma on tehty ryhmämme aiemmin julkaistujen tutkimusten mukaan. Laskemme yksinkertaisen koon mukaan 120 keuhkoahtaumatautipotilasta, 30 keuhkoahtaumatautia sairastavaa potilasta ja 30 kontrollia.

Tavoiteilmoittautuminen/näytteen koko 180 Odotettu ilmoittautumisaste 25 potilasta kuukaudessa Arvioitu tutkimuksen alkamispäivämäärä: Näytteet kerätty Biopankissa 1.12.2019 alkaen Näytteet lähetetty biokemian laboratorioon 01.03.2020 Arvioitu opintojen päättymispäivä: (seurannan loppu) 05.04.2021 Tutkimuksen suunnittelu ja menetelmät Havainnollinen prospektiivinen tutkimus. Potilaita rekrytoidaan keuhkoahtaumatautien poliklinikoista, tupakoinnin lopettamisen poliklinikoista sekä keuhkoahtaumatautien pahenemisen vuoksi sairaalahoidossa olevilta potilailta. Kaikille potilaille annetaan kirjallinen tietoinen suostumus osallistumiseen. Cantabrian eettinen komitea (CEIC) on jo hyväksynyt tämän tutkimuksen.

Osallistujat

1. Stabiili keuhkoahtaumatauti (vähintään 40-vuotiaat, joiden lähtötilanteessa keuhkoputkia laajentavan pakotetun uloshengityksen tilavuus 1 sekunnissa [FEV1]/pakotettu vitaalikapasiteetti [FVC] ≤0,70) rekrytoidaan säännöllisen seurannan aikana.
2. Kontrolliryhmä: ikään ja sukupuoleen sopivat vapaaehtoiset, joilla ei ole aiemmin diagnosoitu keuhkoahtaumatautia tai muita hengityselinten sairauksia ja joilla on keuhkoputkia laajentavan pakotetun uloshengityksen tilavuus 1 sekunnissa [FEV1]/pakotettu vitaalikapasiteetti [FVC] >0,70.
3. Pahenevat keuhkoahtaumatautipotilaat: Potilaat, joilla on aiemmin diagnosoitu keuhkoahtaumatauti (40-vuotiaat tai vanhemmat, joiden lähtötilanteessa keuhkoputkia laajentavan pakotetun uloshengityksen tilavuus 1 sekunnissa [FEV1]/pakotettu vitaalikapasiteetti [FVC] ≤0,70) vietiin sairaalan keuhko-osastolle keuhkoahtaumatautien pahenemisen vuoksi.

Charlson Comorbidity Index kirjataan kaikista tutkimukseen osallistuneista. Potilaat, joilla on akuutteja pahenemisvaiheita 1 kuukausi ennen tutkimusta, potilaat, jotka osallistuivat keuhkojen kuntoutukseen tutkimuksen aikana tai 6 kuukautta ennen tutkimusjaksoa ja joilla on muita mahdollisia sarkopenian syitä (pahanlaatuiset sairaudet, sydämen vajaatoiminta, kilpirauhasen liikatoiminta tai muut krooniset tuhoisat sairaudet) ja potilaat, joilla on tunnetut krooniset munuaissairaudet tai äskettäinen akuutti munuaisvaurio jätetään tutkimuksen ulkopuolelle. Verinäytteet ja kaikki muut mittaukset tehdään samana päivänä, jolloin potilaat hyväksyvät osallistumisen tutkimukseen.

Kliiniset ominaisuudet

Tutkimukseen ilmoittautumisen yhteydessä keuhkoahtaumatautipotilaat jaetaan eri luokkiin: (1) oireettomat potilaat (COPD Assessment Test [CAT] -pistemäärä < 10) vs. oireelliset potilaat (CAT-pisteet ≥10), (2) ei-dyspneiset potilaat. (muokattu Medical Research Councilin hengenahdistuspistemäärä [mMRC] < 2) verrattuna hengenahdistuspotilaisiin (mMRC ≥2), suuri pahenemisriski (potilailla, joilla on vähintään 2 pahenemisvaihetta, jotka vaativat hoitoa antibiootilla tai systeemisillä steroideilla tai vähintään yhden sairaalahoidon edellisellä kerralla vuosi) verrattuna alhaiseen pahenemisriskin potilaiden ja (4) entisten tupakoitsijoiden verrattuna aktiiviseen tupakoitsijaan. Tutkimukseen osallistumisen jälkeen otetaan verinäytteitä ja potilaita seurataan 1 vuoden ajan (yksi käynti 6 kuukauden kuluttua ja yksi käynti 12 kuukauden kuluttua) ja kirjataan pahenemisvaiheet ja sairaalahoidot prospektiivisesti. Seurantajakson aikana kaikki tutkimuksessa mukana olevat kliiniset tutkijat sokeutuvat mitokiinien tuloksiin. Tänä aikana potilaita, joilla on mahdollisia keuhkojen pahenemisvaiheita, ohjataan vapaasti menemään sairaalan päivystykseen ja lääkäriryhmä päättää vapaasti omien kliinisten kriteeriensä mukaan, viedäänkö heidät sairaalaan vai ei.

Mitokiinitasojen mukaan potilaat jaetaan kahteen ryhmään: yksi koostuu mitokiinien korkeimman kvartiilin sisällä olevista ja toiseen ryhmään kuuluvat potilaat, jotka ovat mitokiinien kolmen muun kvartiilin sisällä.

Mittaukset Perusdyspnea kirjataan mMRC-dyspnea-asteikolla. CAT-pisteet kirjataan itse täytettävällä kyselylomakkeella. Aiemmat pahenemisvaiheet kirjataan tutkimukseen osallistuneiden potilaiden kliinisistä tiedoista. Spirometria mitataan American Thoracic Society/European Respiratory Societyn (ATS/ERS) mukaan kaikissa aiheissa.

Kehon koostumus arvioidaan biosähköisellä impedanssilaitteella (OMROM BF511, Omrom, Japani), ja FFMI lasketaan FFM:n ja pituuden suhteena metreinä neliöinä. 6 minuutin kävelytesti suoritetaan American Thoracic Societyn protokollan mukaisesti: potilaita pyydettiin kävelemään mahdollisimman pitkälle 6 minuutissa 30 metrin suorassa käytävässä ilman keskeytyksiä. Testin lopussa kirjataan potilaiden kävelemä matka ja hengenahdistus. Humaniini ja MOTS-c mitataan ELISA:lla (Mybiosource), FGF21 ja GDF15. Mitataan ELISA:lla (kvantikiini). Jos mahdollista, Romo1 mitataan myös ELISA:lla. Tutkimus jaetaan kolmeen käyntiin: VISIT 1: Verinäytteenotto ja kliiniset ominaisuudet. KÄYTTÖ 2: 6 kuukautta käynnin 1 jälkeen: pahenemisvaiheet ja sairaalakäynnit (numero ja päivämäärä) käynnin 1 jälkeen. KÄYTTÖ 3: 12 kuukautta käynnin 1 jälkeen: Pahenemisvaiheet ja sairaalakäynnit (numero ja päivämäärä) käynnin 2 jälkeen.

Tutkimuksen päätetapahtumat Ensisijainen päätetapahtuma: Mitokiinien avulla voidaan arvioida keuhkoahtaumatautipotilaiden sairaalahoitoon pääsyn riskiä.

Toissijaiset päätepisteet:

1. -Mitokiinien avulla voidaan arvioida keuhkoahtaumatautipotilaiden pahenemisriskiä.
2. - Mitokiinit ovat muuttuneet COPD-potilailla.
3. - Mitokiinit muuttuvat COPD:n pahenemisvaiheissa.
4. - Mitokiinit korreloivat COPD-muuttujien (FEV1, FFMI...) kanssa.

Tilastollinen suunnitelma tai tietojen analyysi Tiedot esitetään keskiarvona ± SD normaalijakauman osalta tai mediaanina (kvartiiliväli) ei-parametrisille tiedoille. Ryhmien väliset erot analysoidaan käyttämällä parittomia t-testejä parametrisille tiedoille tai Mann-Whitneyn testeillä ei-parametrisille tiedoille.

Tietojoukkojen välisiä korrelaatioita tutkittiin käyttämällä Pearson (r) -korrelaatiokerrointa parametrisille tiedoille tai Spearman rank (rs) -korrelaatiokerrointa ei-parametrisille tiedoille. Normaalijakauma testataan Kolmogorov-Smirnov-testillä.

Kaplan-Meierin arvioiden perusteella lasketaan niiden osallistujien osuus, joilla on tapahtuma ajan mittaan. Yksimuuttuja- ja monimuuttuja-analyysi käyttäen Coxin suhteellista riskianalyysiä suoritetaan käyttämällä SPSS-ohjelmiston versiota 25.00 PC:lle, jotta voidaan analysoida ensimmäisten tapahtumien kehitystä mitokiinien perustasojen mukaan sekä tunnistaa pahenemisvaiheisiin ja sairaalahoitoon liittyvät riskitekijät. Erot katsotaan merkittäviksi, jos p-arvot ovat pienempiä kuin 0,05. Kaikki raportoidut p-arvot ovat kaksipuolisia.

Rajoitukset ja eettiset näkökohdat Tämä on yhden keskuksen tutkimus, joten se on toistettava monikeskisissä tutkimuksissa, joissa käytetään useampaa eri maista tulevia potilaita. Vaikka ne ovat kalliita ja monimutkaisia, jotkin tekniikat, kuten lihasbiopsia, ergometria, CT:llä tai sukkulatestillä mitattu lihasmassa voitaisiin suorittaa, jotta saataisiin parempi yleiskuva näiden potilaiden lihasmassasta ja toiminnasta.

Tästä tutkimuksesta ei odoteta olevan haittaa potilaille. Tämän tutkimuksen hyväksyi Cantabrian eettinen komitea (koodi: 2018.276). Vaikka tutkimusta rahoittaa yritys GlaxoSmithKline (GSK), se on riippumaton tutkimus, eivätkä tutkijat saa taloudellista korvausta.