Mitoquinas na DPOC

INTRODUÇÃO A Doença Pulmonar Obstrutiva Crônica (DPOC) caracteriza-se pela obstrução progressiva e dificilmente reversível das vias aéreas, que afeta basicamente as pequenas vias aéreas (bronquiolite obstrutiva crônica), associada variavelmente à destruição do parênquima pulmonar (enfisema). 10% das pessoas com mais de 45 anos têm DPOC. Espera-se que a DPOC seja a terceira principal causa de mortalidade no mundo até 2020. A principal causa de DPOC nos países ocidentais é o contato crônico da fumaça do tabaco com as vias aéreas, com entrada maciça de muitas substâncias tóxicas e espécies reativas de oxigênio (ROS) para o corpo que induzem o estresse oxidativo (OS). A OS na DPOC é exógena (ROS inalada) e endógena (ROS induzida por substâncias tóxicas do tabaco e pela própria doença). Alguns investigadores consideram que a OS na DPOC está intimamente relacionada com um tipo peculiar de senescência celular acelerada associada a um processo inflamatório crónico que afeta não só o sistema respiratório, mas também muitas outras partes do corpo (músculo esquelético, sistema cardiovascular, metabolismo global , sistema imunológico, etc.).

A disfunção mitocondrial desempenha um papel central, mas não exclusivo, no estresse oxidativo, senescência celular e inflamação crônica. Assim, uma melhor compreensão da disfunção mitocondrial subjacente à DPOC permitiria compreender melhor a fisiopatologia e identificar novos possíveis alvos terapêuticos. As alterações mitocondriais da DPOC nas áreas broncopulmonar, muscular e imunológica estão amplamente documentadas tanto morfologicamente quanto fisiopatologicamente. A disfunção mitocondrial pode ser primária (congênita) ou secundária (adquirida, como no caso do tabagismo). É um conceito amplo que inclui produção de energia celular prejudicada, geração excessiva de ROS ou de alguns metabólitos do ciclo de Krebs na mitocôndria e perda do controle de qualidade de componentes mitocondriais essenciais que finalmente levam à produção anormal de moléculas intramitocondriais (mtDNA, ATP, citocromo c, Romo1 etc.) para o citosol e fluidos extracelulares. Algumas dessas moléculas se comportam como DAMPs (padrões moleculares associados a danos) e induzem uma ativação da imunidade inata e, portanto, inflamação. Os níveis sanguíneos de citocromo C e Romo1 têm sido propostos como marcadores de estresse oxidativo. A principal função da mitocôndria é a geração de ATP, a molécula básica de transporte de energia para a manutenção da célula viva. A geração de ATP é produzida a partir de outros precursores energéticos na mitocôndria através do sistema de fosforilação oxidativa acoplado à cadeia transportadora de elétrons (OXPHOS/ETC). Essas organelas também desempenham um papel fundamental em 1) a geração de metabólitos específicos de carboidratos, lipídios e proteínas, essenciais para múltiplas funções celulares, 2) a síntese de hemes e hormônios esteróides, 3) o gerenciamento dos "clusters" de Fe e S, 4) homeostase celular do cálcio intracelular, 5) resposta imune, tanto inata quanto adquirida, e 6) regulação de alguns tipos de apoptose.

As células reagem continuamente às mudanças ambientais às quais estão expostas. Em situações de estresse celular (ex. privação calórica, falta de nutrientes específicos, mudanças de temperatura, etc.) o núcleo celular reage enviando sinais às mitocôndrias para que modifiquem a sua função para se adaptarem à mudança (sinalização anterógrada do núcleo para as mitocôndrias: por exemplo o exercício físico consome ATP na célula muscular, que ativa a AMPK, que ativa o cofator de transcrição nuclear PGC-1alfa, que por sua vez ativa OXPOS/ETC e a biogênese mitocondrial). Por outro lado, quando existe uma situação estressante nas próprias mitocôndrias (ex. produção excessiva de radicais livres de oxigênio, proteínas intramitocondriais desdobradas, etc) são enviados sinais ao núcleo para que este modifique a produção de proteínas destinadas a prevenir/corrigir danos mitocondriais, incluindo chaperonas, antioxidantes ou enzimas proteolíticas proteolíticas (sinalização retrógrada autonômica ou intracelular) .

Recentemente, as mitocôndrias demonstraram ser capazes de gerar direta ou indiretamente peptídeos que não apenas influenciam a própria célula que os produz, mas também têm efeitos à distância (sinalização não autônoma ou retrógrada extracelular). Essas substâncias, descobertas pelo grupo de Dillin, são chamadas de mitoquinas e enviam sinais de tecidos com mitocôndrias estressadas para todo o corpo, sendo hormônios que preparam todo o organismo para responder ao estresse celular a que vai ser submetido.

As mitoquinas são liberadas quando há algum tipo de estresse mitocondrial (mutações congênitas ou adquiridas no mtDNA, distúrbios do OXPHOS/ETC que geram estresse oxidativo, toxinas mitocondriais, etc.). Em mamíferos, o estresse mitocondrial é geralmente associado à chamada resposta celular integrada ao estresse (ICRS)". Um dos mecanismos mais importantes do ICRS é o UPR (Unfolded protein response), no qual as mitocôndrias participam de forma coordenada com o sistema do retículo endoplasmático e o núcleo celular.

Existem pelo menos dois tipos diferentes de mitoquinas: 1) mitoquinas primárias, codificadas no DNA mitocondrial (mtDNA) e 2) mitocinas secundárias, codificadas no DNA do núcleo (nDNA), cuja secreção é regulada por sinais de ativação das mitocôndrias estressadas para o nDNA (por exemplo ATF4, etc). Humanina (HN), MOTS-c (Mitochondrial ORF of the Twelve S-c) e seis peptídeos semelhantes à humanina (SHLPs 1-6) são consideradas mitoquinas primárias, embora o número possa ser maior. Até recentemente, pensava-se que o DNA mitocondrial codificava apenas 37 genes (13 peptídeos encontrados exclusivamente na mitocôndria, todos subunidades da ETC, 22 RNAs de transferência -tRNA- e 2 RNAs ribossomais -rRNA-). Agora sabemos que 16s e 12s rRNA contêm sORFs ("short open reading frames") que traduzem peptídeos secretores de 20-30 aa. Não se sabe quais mecanismos íntimos regulam a síntese e liberação dessas mitoquinas, embora seja possível que estejam relacionados a uma ativação ribossomal mitocondrial. Em relação às mitoquinas secundárias (aquelas codificadas no DNA nuclear) sob a ativação do ATF4, conhecemos o fator de crescimento fibroblástico 21 (FGF21), fator de crescimento e desenvolvimento 15 (MIC1/GDF15), folistatina e intermedina-adrenomedulina2. Essas mitoquinas também respondem a outros estímulos, independente da mitocôndria.

A humanina é um peptídeo de 21 ou 24 aa, com múltiplas funções citoprotetoras contra danos mitocondriais (aumenta a síntese de antioxidantes e chaperonas para 4 proteínas não dobradas). É anti-inflamatório (reduz as citocinas inflamatórias e aumenta as citocinas anti-inflamatórias) e antiapoptótico (bloqueia fatores apoptóticos como Bak e IGFBP3), através de pelo menos 2 receptores de membrana e várias interações com outras proteínas intracelulares e extracelulares, em muitos tecidos (sistema nervoso, fígado, coração, parede vascular, músculo esquelético, epitélio pigmentar da retina, gônadas etc). Também tem efeitos metabólicos benéficos (diminui a resistência à insulina no nível central, protege a célula beta pancreática do estresse oxidativo e tem feedback negativo com o IGF1). Recentemente, foi comprovado que pessoas com altos níveis desse hormônio têm menos comprometimento cognitivo com a idade e também são muito longevas.

O MOTS-c é outro pequeno peptídeo de 16 aa, codificado pelo mtDNA, mas sintetizado exclusivamente nos ribossomos citosólicos, que também possui efeitos antioxidantes e metabólicos benéficos, pois diminui a resistência à insulina e previne a obesidade. Por outro lado, aumenta a resistência contra algumas infecções aumenta e diminui a reabsorção óssea, pelo que pode ter efeitos antiosteoporóticos. Ambas as hormonas são mensuráveis ​​no sangue por ELISA, embora existam algumas discrepâncias nos seus níveis plasmáticos dependendo do teste utilizado.

O FGF21 é um hormônio bem caracterizado que estimula a cetogênese e a oxidação beta de ácidos graxos. A sua secreção é regulada pelo jejum e ativação dos recetores PPAR-α, mas sabe-se também que se eleva em qualquer situação de stress mitocondrial que ativa sinais mitocôndria-para-núcleo. O MIC1/GDF15 é outro hormônio circulante que reduz a fome, ativando um nível de receptor específico (GFRAL) encontrado na área postrema e no núcleo do trato solitário. Níveis elevados de GDF15 foram encontrados na caquexia do câncer e em muitas outras situações, entre elas a DPOC. Também é liberado quando os sinais mitocondriais para o núcleo são ativados. Na DPOC, de todas as mitoquinas aqui revisadas, há apenas informações sobre os níveis sanguíneos de GDF15, mas não há dados na literatura sobre os níveis das outras mitoquinas. À medida que a DPOC progride, é provável que os níveis sanguíneos de mitoquinas aumentem progressivamente, expressando maior deterioração da função mitocondrial, embora seus níveis possam aumentar apenas até certo nível e depois diminuir quando o dano mitocondrial é insuportável, constituindo assim uma espécie de resposta mitohormética. HIPÓTESE As mitoquinas, expressas no contexto da disfunção mitocondrial, estão alteradas em pacientes com DPOC e estão associadas a piores desfechos clínicos. Além disso, as mitoquinas podem ser usadas como fatores prognósticos e potenciais alvos terapêuticos na DPOC. OBJETIVOS

1. - Descrever os níveis de mitoquinas em um grupo controle, um grupo de pacientes ambulatoriais com DPOC estável e um grupo de pacientes com DPOC exacerbada.
2. - Descrever diferenças nos níveis de semitons em diferentes grupos de pacientes com DPOC (diferentes níveis de obstrução, pacientes com alto risco de exacerbação versus nenhum risco de exacerbação, pacientes com escore CAT <10 versus o restante dos pacientes, pacientes com baixo índice de gordura índice de massa (FFMI) vs. resto dos pacientes).
3. -Avaliar a correlação entre semitons e diferentes desfechos clínicos, como FFMI, distância percorrida no teste de caminhada de 6 minutos, VEF1, escore CAT.
4. - Avaliar se as mitoquinas podem ser usadas para prever o risco futuro de exacerbação e internação hospitalar.

MÉTODOS

População do estudo

Critérios de inclusão e exclusão:

Pacientes com DPOC estável: serão selecionados nos ambulatórios de Pneumologia do Hospital

Universitario Marqués de Valdecilla. Os pacientes com DPOC devem atender aos seguintes critérios:

40 anos ou mais com volume expiratório forçado basal pós-broncodilatador em 1 s [FEV1]/capacidade vital forçada [CVF] ≤0,70.

Pacientes com DPOC exacerbada: Serão selecionados pacientes internados no Hospital Universitário Marqués de Valdecilla com diagnóstico de exacerbação de DPOC.

Grupo controle: será obtido de pacientes sem DPOC ou qualquer outra condição respiratória aguda ou crônica e familiares dos pacientes.

Aceitando um risco alfa de 0,05 e um risco beta de 0,2 no teste bilateral são necessários 30 sujeitos no primeiro grupo e 90 no segundo para encontrar uma diferença de proporção estatisticamente significativa que se espera ser de 0,45 no grupo 1 e 0,1 no grupo 2 .Antecipando uma taxa de abandono de 5%. A aproximação ARCSINUS. Este cálculo foi realizado de acordo com estudos previamente publicados realizados por nosso grupo. Calculamos um tamanho simples de 120 pacientes com DPOC, 30 pacientes com exacerbação da DPOC e 30 controles.

Alvo de inscrição/tamanho da amostra 180 Taxa prevista de inscrição 25 pacientes por mês Data estimada de início do estudo: Amostras coletadas no Biobank a partir de 01.12.2019 Amostras enviadas ao laboratório de bioquímica 01.03.2020 Data estimada de conclusão do estudo: (fim do acompanhamento) 05.04.2021 Desenho do estudo e métodos Estudo prospectivo observacional. Os pacientes serão recrutados em ambulatórios de DPOC, ambulatórios para cessação do tabagismo e de pacientes hospitalizados devido à exacerbação da DPOC. Todos os pacientes receberão consentimento informado por escrito para participar. Este estudo já foi aprovado pelo Comitê de Ética da Cantábria (CEIC).

participantes

1. A DPOC estável (40 anos ou mais com volume expiratório forçado basal pós-broncodilatador em 1 s [FEV1]/capacidade vital forçada [CVF] ≤ 0,70) será recrutada durante seu acompanhamento regular.
2. Grupo controle: voluntários pareados por idade e sexo sem diagnóstico prévio de DPOC ou outras condições respiratórias e com volume expiratório forçado em 1 s pós-broncodilatador [VEF1]/capacidade vital forçada [CVF] >0,70.
3. Pacientes com DPOC exacerbada: Pacientes com diagnóstico prévio de DPOC (40 anos ou mais com volume expiratório forçado basal pós-broncodilatador em 1 s [FEV1]/capacidade vital forçada [CVF] ≤0,70) admitidos na enfermaria de pneumologia do hospital por exacerbação de DPOC.

O índice de comorbidade de Charlson será registrado para todos os participantes do estudo. Pacientes com exacerbações agudas 1 mês antes do estudo, pacientes incluídos em reabilitação pulmonar durante o estudo ou 6 meses antes do período de inclusão, com outras causas potenciais de sarcopenia (doenças malignas, insuficiência cardíaca, hipertireoidismo ou outras doenças crônicas devastadoras) e pacientes com doenças renais crônicas conhecidas ou lesão renal aguda recente serão excluídos do estudo. As amostras de sangue e todas as outras medições serão feitas no mesmo dia em que os pacientes aceitarem entrar no estudo.

Características clínicas

Na inscrição no estudo, os pacientes com DPOC serão divididos em diferentes grupos categóricos: (1) pacientes não sintomáticos (pontuação do COPD Assessment Test [CAT] < 10) versus pacientes sintomáticos (escore CAT ≥10), (2) pacientes não dispneicos (escore de dispneia modificado do Medical Research Council [mMRC] < 2) versus pacientes dispneicos (mMRC ≥2), pacientes com alto risco de exacerbação (aqueles com 2 ou mais exacerbações que requerem tratamento com antibióticos ou esteróides sistêmicos ou pelo menos uma internação hospitalar na última ano) versus pacientes com baixo risco de exacerbação e (4) ex-fumantes versus fumantes ativos. Depois de entrar no estudo, amostras de sangue serão obtidas e os pacientes serão acompanhados por 1 ano (uma visita após 6 meses e uma visita após 12 meses) e exacerbações e internações hospitalares serão registradas prospectivamente. Durante o período de acompanhamento, todos os investigadores clínicos do estudo não terão conhecimento dos resultados das mitoquinas. Nesse período, os pacientes com possíveis exacerbações pulmonares serão orientados a se dirigirem livremente ao Pronto Atendimento do Hospital e essa equipe de médicos decidirá livremente pela internação ou não, de acordo com seus próprios critérios clínicos.

De acordo com os níveis de mitoquinas, os pacientes serão divididos em dois grupos: um composto por aqueles dentro do quartil mais alto das mitoquinas e o outro grupo incluirá pacientes nos outros três quartis dos níveis de mitoquinas.

Medições A dispneia basal será registrada usando a escala de dispneia mMRC. A pontuação do CAT será registrada por meio de questionário autoaplicável. As exacerbações anteriores serão registradas nos registros clínicos dos pacientes incluídos no estudo. A espirometria será medida de acordo com a American Thoracic Society/European Respiratory Society (ATS/ERS) em todas as disciplinas.

A composição corporal será estimada por um dispositivo de impedância bioelétrica (OMROM BF511, Omrom, Japão), e o FFMI será calculado como a razão entre a MLG e a altura em metros ao quadrado. O teste de caminhada de 6 minutos será realizado de acordo com o protocolo da American Thoracic Society: os pacientes foram solicitados a caminhar a maior distância possível em 6 minutos em um corredor reto de 30 m sem interrupção. Ao final do teste, serão registradas a distância percorrida pelos pacientes e a dispnéia. Humanina e MOTS-c serão medidos por ELISA (Mybiosource), FGF21 e GDF15. Será medido por ELISA (Quantikine). Se possível, Romo1 também será medido por ELISA. O estudo será dividido em 3 visitas: VISITA 1: Coleta de amostra de sangue e características clínicas. VISITA 2: 6 meses após a visita 1: Exacerbações e internações (número e data) após a visita 1. VISITA 3: 12 meses após a visita 1: Exacerbações e internações (número e data) após a visita 2.

Desfechos do estudo Desfecho primário: Mitoquinas podem ser usadas para estimar o risco de internação hospitalar em pacientes com DPOC.

Pontos de extremidade secundários:

1. -Mitoquinas podem ser usadas para estimar o risco de exacerbação da DPOC em pacientes com DPOC.
2. - As mitoquinas estão alteradas em pacientes com DPOC.
3. - As mitoquinas estão alteradas nas exacerbações da DPOC.
4. - As mitoquinas correlacionam-se com diferentes variáveis ​​da DPOC (FEV1, FFMI..).

Plano estatístico ou análise de dados Os dados serão apresentados como média ± DP para dados normalmente distribuídos ou mediana (faixa interquartil) para dados não paramétricos. As diferenças entre os grupos serão analisadas usando testes t não pareados para dados paramétricos ou testes de Mann-Whitney para dados não paramétricos.

As correlações entre os conjuntos de dados foram examinadas usando o coeficiente de correlação de Pearson (r) para dados paramétricos ou o coeficiente de correlação de classificação de Spearman (rs) para dados não paramétricos. A distribuição normal será testada usando um teste de Kolmogorov-Smirnov.

As estimativas de Kaplan-Meier serão usadas para calcular a proporção de participantes que têm um evento ao longo do tempo. A análise univariada e multivariada usando a análise de risco proporcional de Cox será realizada usando o software SPSS versão 25.00 para PC para analisar o desenvolvimento dos primeiros eventos de acordo com os níveis basais de mitoquinas e identificar fatores de risco associados a exacerbações e hospitalização. As diferenças serão consideradas significativas se os valores de p forem menores que 0,05. Todos os valores de p relatados serão bilaterais.

Limitações e considerações éticas Este é um estudo unicêntrico, portanto, deve ser replicado em estudos multicêntricos, utilizando um número maior de pacientes provenientes de diferentes países. Embora dispendiosas e complicadas, algumas técnicas como biópsia muscular, ergometria, quantificação da massa muscular por TC ou teste de vaivém poderiam ser realizadas a fim de se ter uma melhor visão geral da massa e função muscular nesses pacientes.

Nenhum dano potencial para os pacientes é esperado a partir deste estudo. Este estudo foi aprovado pelo comitê de ética da Cantábria (Código: :2018.276). Embora o estudo seja financiado pela empresa GlaxoSmithKline (GSK), é um estudo independente e os investigadores não recebem nenhuma compensação financeira.