Mitokiner vid KOL

INTRODUKTION Kronisk obstruktiv lungsjukdom (KOL) kännetecknas av progressiv och knappast reversibel obstruktion av luftvägarna, vilket i grunden påverkar de små luftvägarna (kronisk obstruktiv bronkiolit), varierande i samband med förstörelse av lungparenkymet (emfysem). 10 % av personer över 45 år har KOL. KOL förväntas vara den tredje vanligaste dödsorsaken i världen år 2020. Den främsta orsaken till KOL i västerländska länder är kronisk tobaksrökskontakt med luftvägarna, med massiv inträngning av många giftiga ämnen och reaktiva syrearter (ROS) till kroppen som inducerar oxidativ stress (OS). OS vid KOL är både exogent (ROS inhalerat) och endogent (ROS inducerat av tobaksgifter och av den egna sjukdomen). Vissa forskare anser att OS vid KOL är nära besläktat med en speciell typ av accelererad cellulär åldrande associerad med en kronisk inflammatorisk process som inte bara påverkar andningssystemet utan även många andra delar av kroppen (skelettmuskulatur, kardiovaskulära systemet, global metabolism immunologiskt system, etc.).

Mitokondriell dysfunktion spelar en central, men inte exklusiv, roll vid oxidativ stress, cellulär senescens och kronisk inflammation. Därför skulle en bättre förståelse av den mitokondriella dysfunktionen som ligger bakom KOL göra det möjligt att bättre förstå fysiopatologin och att identifiera nya möjliga terapeutiska mål. De mitokondriella förändringarna av KOL vid bronkopulmonära, muskulära och immunologiska områden är vitt dokumenterade både morfologiskt och patofysiologiskt. Mitokondriell dysfunktion kan vara primär (medfödd) eller sekundär (förvärvad, som i fallet med tobaksrökning). Det är ett brett koncept som inkluderar försämrad cellulär energiproduktion, överdriven generering av ROS eller av vissa metaboliter från Krebs-cykeln i mitokondrierna och förlust av kvalitetskontroll av väsentliga mitokondriella komponenter som slutligen leder till onormal produktion av intramitokondriella molekyler (mtDNA, ATP, cytokrom c, Romo1 etc.) till cytosolen och extracellulära vätskor. Vissa av dessa molekyler beter sig som DAMPs (skadaassocierade molekylära mönster) och inducerar en aktivering av medfödd immunitet, och därmed inflammation. Blodnivåer av Cytokrom C och Romo1 har föreslagits som markörer för oxidativ stress. Mitokondriernas huvudsakliga funktion är att generera ATP, den grundläggande energibärande molekylen för underhållet av den levande cellen. Genereringen av ATP produceras från andra energiprekursorer i mitokondrierna genom det oxidativa fosforyleringssystemet kopplat till elektrontransportkedjan (OXPHOS/ETC). Dessa organeller spelar också en grundläggande roll i 1) genereringen av specifika metaboliter av kolhydrater, lipider och proteiner, som är väsentliga för flera cellulära funktioner, 2) syntesen av hemer och steroidhormoner, 3) hanteringen av "klustren" av Fe och S, 4) cellulär homeostas av intracellulärt kalcium, 5) immunsvar, både medfödd och förvärvad, och 6) reglering av vissa typer av apoptos.

Celler reagerar kontinuerligt på de miljöförändringar som de utsätts för. I situationer med cellulär stress (t.ex. kaloribrist, brist på specifika näringsämnen, temperaturförändringar etc.) cellkärnan reagerar genom att skicka signaler till mitokondrierna så att de modifierar sin funktion för att anpassa sig till förändringen (anterograd signalering från kärnan till mitokondrierna: till exempel fysisk träning tär på ATP i muskelcellen, vilket aktiverar AMPK, som aktiverar nukleär transkriptionskofaktor PGC-1alpha, som i sin tur aktiverar OXPOS/ETC och mitokondriell biogenes). Å andra sidan, när det finns en stressig situation i mitokondrierna själva (t.ex. överdriven produktion av fria syreradikaler, ovikta intramitokondriella proteiner, etc) skickas signaler till kärnan för att den ska modifiera produktionen av proteiner avsedda att förhindra/korrigera mitokondriella skador, inklusive chaperoner, antioxidanter eller proteolytiska enzymer proteolytiska (autonom eller intracellulär retrograd signalering) .

Mitokondrier har nyligen visat sig vara kapabla att direkt eller indirekt generera peptider som inte bara påverkar den egna cellen som producerar dem, utan de har effekter på avstånd (icke-autonom eller extracellulär retrograd signalering). Dessa ämnen, som upptäckts av Dillins grupp, kallas mitokiner och skickar signaler från vävnader med stressade mitokondrier till hela kroppen, hormoner som förbereder hela organismen att svara på den cellulära stress den kommer att utsättas för.

Mitokiner frisätts när det finns någon form av mitokondriell stress (medfödda eller förvärvade mutationer i mtDNA, störningar i OXPHOS/ETC som genererar oxidativ stress, mitokondriella toxiner, etc.). Hos däggdjur är mitokondriell stress i allmänhet associerad med det så kallade integrerade cellulära svaret på stressen (ICRS)". En av de viktigaste mekanismerna för ICRS är UPR (Unfolded protein response), där mitokondrier deltar på ett koordinerat sätt med det endoplasmatiska retikulumsystemet och cellkärnan.

Det finns minst två olika typer av mitokiner: 1) primära mitokiner, kodade i mitokondrie-DNA (mtDNA) och 2) sekundära mytokiner, kodade i kärn-DNA (nDNA), vars utsöndring regleras genom aktiveringssignaler från de stressade mitokondrierna till nDNA (t.ex. ATF4, etc). Humanin (HN), MOTS-c (Mitochondrial ORF of the Twelve S-c) och sex peptider som liknar humanin (SHLPs 1-6) anses vara primära mitokiner, även om antalet kan vara högre. Tills nyligen trodde man att mitokondrie-DNA endast kodade för 37 gener (13 peptider som uteslutande finns i mitokondrierna, alla underenheter av ETC, 22 överförings-RNA -tRNA- och 2 ribosomala RNA -rRNA-) RNA. Vi vet nu att 16s och 12s rRNA innehåller sORFs ("korta öppna läsramar") som översätter sekretoriska peptider från 20-30 aa. Det är inte känt vilka intima mekanismer som reglerar syntesen och frisättningen av dessa mitokiner, även om det är möjligt att de är relaterade till en mitokondriell ribosomal aktivering. När det gäller sekundära mitokiner (de som kodas i nukleärt DNA) under aktiveringen av ATF4 känner vi till fibroblastisk tillväxtfaktor 21 (FGF21), tillväxt- och utvecklingsfaktor 15 (MIC1/GDF15), follistatin och intermedin-adrenomedullin2. Dessa mitokiner svarar också på andra stimuli, oberoende av mitokondrierna.

Humanin är en peptid på 21 eller 24 aa, med flera cytoprotektiva funktioner mot mitokondriella skador (ökar syntesen av antioxidanter och chaperoner för 4 ovikta proteiner). Det är antiinflammatoriskt (sänker de inflammatoriska cytokinerna och höjer de antiinflammatoriska cytokinerna) och antiapoptotisk (blockerar apoptotiska faktorer som Bak och IGFBP3), genom minst 2 membranreceptorer och flera interaktioner med andra intracellulära och extracellulära proteiner, i många vävnader (nervsystemet, levern, hjärtat, kärlväggen, skelettmuskulaturen, retinalt pigmentepitel, gonader etc). Det har också fördelaktiga metaboliska effekter (minskar insulinresistens på central nivå, skyddar betacellen i bukspottkörteln från oxidativ stress och har negativ feedback med IGF1). Nyligen har det bevisats att personer med höga nivåer av detta hormon har mindre kognitiv försämring med åldern och är också mycket långlivade.

MOTS-c är en annan liten peptid på 16 aa, kodad mtDNA, men syntetiserad uteslutande i de cytosoliska ribosomerna, som också har fördelaktiga antioxidant- och metaboliska effekter, eftersom den minskar insulinresistens och förhindrar fetma. Å andra sidan ökar det motståndet mot vissa infektioner ökar och minskar benresorptionen, så det kan ha antiosteoporotiska effekter. Båda hormonerna är mätbara i blodet med ELISA, även om det finns vissa skillnader i deras plasmanivåer beroende på vilket test som används.

FGF21 är ett välkarakteriserat hormon som stimulerar ketogenes och betaoxidation av fettsyror. Dess utsöndring regleras av fasta och aktivering av receptorerna PPAR-α, men det är också känt att det ökar i alla situationer av mitokondriell stress som aktiverar signaler från mitokondrier till kärna. MIC1/GDF15 är ett annat cirkulerande hormon som minskar hungern, aktiverar en specifik receptornivå (GFRAL) som finns i postrema-området och kärnan i solitärkanalen. Förhöjda nivåer av GDF15 har hittats i cancerkakexi och i många andra situationer, bland dem KOL. Det frigörs också när mitokondrie-till-kärna-signalerna aktiveras. Vid KOL, av alla mitokiner som granskas här, finns det endast information om GDF15-blodnivåer, men det finns inga data i litteraturen om nivåerna av de andra mitokinerna. När KOL fortskrider kommer mitokinernas blodnivåer sannolikt att öka progressivt, vilket uttrycker ytterligare försämring av mitokondriell funktion, även om deras nivåer bara kan öka upp till en viss nivå, och sedan minska när mitokondriell skada är outhärdlig, vilket utgör ett slags mitohormetiskt svar. HYPOTES Mitokiner, uttryckta i samband med mitokondriell dysfunktion, förändras hos KOL-patienter och är associerade med värsta kliniska resultat. Vidare kan mitokiner användas som prognostiska faktorer och potentiella terapeutiska mål vid KOL. MÅL

1. - Att beskriva mitokinnivåer i en kontrollgrupp, en grupp stabila KOL-polikliniska patienter och en grupp exacerberade KOL-patienter.
2. - Att beskriva skillnader i halvtonsnivåer hos olika grupper av KOL-patienter (olika nivåer av obstruktion, patienter med hög risk för exacerbation vs. ingen risk för exacerbation, patienter med CAT-poäng <10 jämfört med övriga patienter, patienter med låg fettfri- Massindex (FFMI) kontra resten av patienterna).
3. -För att utvärdera korrelationen mellan halvtoner och olika kliniska utfall såsom FFMI, promenerad distans i 6 minuters gångtest, FEV1, CAT-poäng.
4. – Att utvärdera om mitokiner kan användas för att förutsäga framtida risk för exacerbation och sjukhusinläggning.

METODER

Studera befolkning

Inklusions- och uteslutningskriterier:

Stabila KOL-patienter: kommer att väljas från pneumologiska polikliniker från sjukhuset

Universitario Marqués de Valdecilla. Patienter med KOL måste uppfylla följande kriterier:

40 år eller äldre med baseline post-bronkodilator forcerad expiratorisk volym på 1 s [FEV1]/tvingad vitalkapacitet [FVC] ≤0,70.

Patienter med exacerberade KOL: Kommer att väljas från patienter inlagda på Hospital Universitario Marqués de Valdecilla med diagnosen KOL-exacerbation.

Kontrollgrupp: kommer att erhållas från patienter utan KOL eller något annat akut eller kroniskt respiratoriskt tillstånd och patienters släktingar.

Att acceptera en alfarisk på 0,05 och en beta-risk på 0,2 i dubbelsidigt test 30 försökspersoner är nödvändiga i den första gruppen och 90 i den andra för att hitta en statistiskt signifikant skillnad som förväntas vara 0,45 i grupp 1 och 0,1 i grupp 2 • Förutse ett bortfall på 5 %. ARCSINUS approximation. Denna beräkning har utförts enligt tidigare publicerade studier utförda av vår grupp. Vi beräknar en enkel storlek på 120 patienter med KOL, 30 patienter med KOL-exacerbation och 30 kontroller.

Målrekrytering/provstorlek 180 Förväntad rekryteringsfrekvens 25 patienter varje månad Beräknat studiestartdatum: Prover insamlade i Biobank från 01.12.2019 Prover skickade till biokemilab 2020-03-01 Beräknat studieslutdatum: (slutet på uppföljningen) 2021-04-05 Studie Design och metoder Observationell prospektiv studie. Patienter kommer att rekryteras från KOL-polikliniker, rökavvänjningsmottagningar och från patienter inlagda på sjukhus på grund av KOL-exacerbation. Alla patienter kommer att ges skriftligt informerat samtycke att delta. Denna studie godkändes redan av Cantabrias etiska kommitté (CEIC).

Deltagare

1. Stabil KOL (40 år eller äldre med påtvingad exspiratorisk volym efter luftrörsvidgande baseline på 1 s [FEV1]/tvingad vitalkapacitet [FVC] ≤0,70) kommer att rekryteras under deras regelbundna uppföljning.
2. Kontrollgrupp: ålders- och könsmatchade frivilliga utan tidigare diagnos av KOL eller andra respiratoriska tillstånd, och med post-bronkdilaterande forcerad expiratorisk volym på 1 s [FEV1]/tvingad vitalkapacitet [FVC] >0,70.
3. Förvärrade KOL-patienter: Patienter med tidigare KOL-diagnos (40 år eller äldre med tvångsvolym efter luftrörsvidgare vid baseline på 1 s [FEV1]/tvingad vitalkapacitet [FVC] ≤0,70) inlagda på sjukhusets lungavdelning på grund av KOL-exacerbation.

Charlson Comorbidity Index kommer att registreras från alla deltagare i studien. Patienter med akuta exacerbationer 1 månad före studien, patienter inkluderade i pulmonell rehabilitering under studien eller 6 månader före inklusionsperioden, med andra potentiella orsaker till sarkopeni (maligna sjukdomar, hjärtsvikt, hypertyreos eller andra kroniska förödande sjukdomar) och patienter med kända kroniska njursjukdomar eller nyligen inträffad akut njurskada kommer att uteslutas från studien. Blodprover och alla andra mätningar kommer att göras samma dag som patienter accepterar att delta i studien.

Kliniska egenskaper

Vid inskrivningen i studien kommer KOL-patienter att delas in i olika kategoriska grupper: (1) icke-symptomatiska patienter (COPD Assessment Test [CAT] poäng < 10) kontra symtomatiska patienter (CAT-poäng ≥10), (2) icke-dyspnéiska patienter (modifierad Medical Research Council dyspnépoäng [mMRC] < 2) jämfört med dyspnépatienter (mMRC ≥2), hög risk för exacerbationspatienter (de med 2 eller fler exacerbationer som kräver behandling med antibiotika eller systemiska steroider eller minst en sjukhusinläggning i föregående år) jämfört med patienter med låg risk för exacerbation, och (4) före detta rökare kontra aktiva rökare. Efter att ha gått in i studien kommer blodprov att tas, och patienter kommer att följas upp i 1 år (ett besök efter 6 månader och ett besök efter 12 månader) och exacerbationer och sjukhusinläggningar kommer att registreras prospektivt. Under uppföljningsperioden kommer alla kliniska utredare i studien att bli blinda för mitokines resultat. Under denna period kommer patienter med möjliga lungexacerbationer att instrueras att gå fritt till akutmottagningen på sjukhuset och det teamet av läkare kommer fritt att besluta om de ska läggas in på sjukhus eller inte, enligt deras egna kliniska kriterier.

Enligt mitokinnivåerna kommer patienter att delas in i två grupper: en sammansatt av de inom den högsta kvartilen av mitokinerna och den andra gruppen kommer att inkludera patienter i de andra tre kvartilerna av nivåerna av mitokiner.

Mätningar Basal dyspné kommer att registreras med hjälp av mMRC dyspnéskala. CAT-poängen kommer att registreras med enkäter som administreras själv. Tidigare exacerbationer kommer att registreras från kliniska journaler från patienter som ingår i studien. Spirometri kommer att mätas enligt American Thoracic Society/European Respiratory Society (ATS/ERS) i alla ämnen.

Kroppssammansättningen kommer att uppskattas av en bioelektrisk impedansenhet (OMROM BF511, Omrom, Japan), och FFMI kommer att beräknas som förhållandet mellan FFM och höjden i meter i kvadrat. 6-minuters gångtestet kommer att utföras enligt protokollet från American Thoracic Society: patienterna ombads gå så långt de kan på 6 minuter i en 30 m rak korridor utan avbrott. I slutet av testet kommer den sträcka som patienterna har gått och dyspné att registreras. Humanin och MOTS-c kommer att mätas med ELISA (Mybiosource), FGF21 och GDF15. Kommer att mätas med ELISA (Quantikine). Om möjligt kommer Romo1 också att mätas med ELISA. Studien kommer att delas upp i 3 besök: BESÖK 1: Blodprovtagning och kliniska egenskaper. BESÖK 2: 6 månader efter besök 1: Exacerbationer och sjukhusinläggningar (antal och datum) efter besök 1. BESÖK 3: 12 månader efter besök 1: Exacerbationer och sjukhusinläggningar (antal och datum) efter besök 2.

Studiens effektmått Primär endpoint: Mitokiner kan användas för att uppskatta risken för sjukhusinläggning hos KOL-patienter.

Sekundära slutpunkter:

1. -Mitokiner kan användas för att uppskatta risken för exacerbation av KOL hos KOL-patienter.
2. - Mitokiner förändras hos KOL-patienter.
3. - Mitokiner förändras vid KOL-exacerbationer.
4. - Mitokiner korrelerar med olika KOL-variabler (FEV1, FFMI..).

Statistisk plan eller dataanalys Data kommer att presenteras som medelvärde ± SD för normalfördelade data eller median (interkvartilintervall) för icke-parametriska data. Skillnader mellan grupper kommer att analyseras med oparade t-tester för parametriska data eller Mann-Whitney-tester för icke-parametriska data.

Korrelationer mellan datamängder undersöktes med Pearson (r) korrelationskoefficient för parametriska data eller Spearman rank (rs) korrelationskoefficient för icke-parametriska data. Normalfördelning kommer att testas med ett Kolmogorov-Smirnov-test.

Kaplan-Meier uppskattningar kommer att användas för att beräkna andelen deltagare som har ett evenemang över tid. Univariat och multivariat analys med hjälp av Cox proportionella riskanalys kommer att utföras med SPSS Software version 25.00 för PC för att analysera utvecklingen av de första händelserna enligt basala nivåer av mitokiner, och för att identifiera riskfaktorer associerade med exacerbationer och sjukhusvistelse. Skillnader kommer att anses vara signifikanta om p-värdena var mindre än 0,05. Alla rapporterade p-värden kommer att vara dubbelsidiga.

Begränsningar och etiska överväganden Detta är en encenterstudie, så den måste replikeras i multicentriska studier med ett större antal patienter från olika länder. Även om det är dyrt och komplicerat, skulle vissa tekniker som muskelbiopsi, ergometri, muskelmassa kvantifierad med CT eller shuttletest kunna utföras för att få en bättre överblick över muskelmassa och funktion hos dessa patienter.

Ingen potentiell skada för patienter förväntas av denna studie. Denna studie godkändes av Kantabriens etiska kommitté (kod: :2018.276). Även om studien finansieras av företaget GlaxoSmithKline (GSK) är den en oberoende studie och utredarna får ingen ekonomisk ersättning.