Mitochine nella BPCO

INTRODUZIONE La Broncopneumopatia Cronica Ostruttiva (BPCO) è caratterizzata da un'ostruzione progressiva e difficilmente reversibile delle vie aeree, che interessa essenzialmente le piccole vie aeree (bronchiolite cronica ostruttiva), variamente associata a distruzione del parenchima polmonare (enfisema). Il 10% delle persone di età superiore ai 45 anni ha la BPCO. Si prevede che la BPCO sarà la terza causa di mortalità nel mondo entro il 2020. La principale causa di BPCO nei paesi occidentali è il contatto cronico del fumo di tabacco con le vie aeree, con l'ingresso massiccio di molte sostanze tossiche e specie reattive dell'ossigeno (ROS) nel corpo che inducono stress ossidativo (OS). L'OS nella BPCO è sia esogeno (ROS inalato) che endogeno (ROS indotto da sostanze tossiche del tabacco e dalla stessa malattia). Alcuni ricercatori ritengono che l'OS nella BPCO sia strettamente correlata a un tipo peculiare di senescenza cellulare accelerata associata a un processo infiammatorio cronico che colpisce non solo l'apparato respiratorio, ma anche molte altre parti del corpo (muscolo scheletrico, sistema cardiovascolare, metabolismo globale , sistema immunitario, ecc.).

La disfunzione mitocondriale svolge un ruolo centrale, ma non esclusivo, nello stress ossidativo, nella senescenza cellulare e nell'infiammazione cronica. Pertanto, una migliore comprensione della disfunzione mitocondriale alla base della BPCO consentirebbe di comprendere meglio la fisiopatologia e di identificare nuovi possibili bersagli terapeutici. Le alterazioni mitocondriali della BPCO a livello broncopolmonare, muscolare e immunologico sono ampiamente documentate sia morfologicamente che fisiopatologicamente. La disfunzione mitocondriale può essere primaria (congenita) o secondaria (acquisita, come nel caso del fumo di tabacco). Si tratta di un concetto ampio che comprende la ridotta produzione di energia cellulare, l'eccessiva generazione di ROS o di alcuni metaboliti dal ciclo di Krebs nei mitocondri e la perdita del controllo di qualità dei componenti mitocondriali essenziali che alla fine portano a una produzione anormale di molecole intramitocondriali (mtDNA, ATP, citocromo c, Romo1 ecc.) al citosol e ai fluidi extracellulari. Alcune di queste molecole si comportano come DAMP (modelli molecolari associati al danno) e inducono un'attivazione dell'immunità innata e quindi l'infiammazione. I livelli ematici di citocromo C e Romo1 sono stati proposti come marcatori di stress ossidativo. La funzione principale dei mitocondri è la generazione di ATP, la molecola portatrice di energia fondamentale per il mantenimento della cellula vivente. La generazione di ATP è prodotta da altri precursori energetici nei mitocondri attraverso il sistema di fosforilazione ossidativa accoppiato alla catena di trasporto degli elettroni (OXPHOS/ETC). Questi organelli svolgono anche un ruolo fondamentale nella 1) generazione di specifici metaboliti di carboidrati, lipidi e proteine, essenziali per molteplici funzioni cellulari, 2) nella sintesi di eme e ormoni steroidei, 3) nella gestione dei "cluster" di Fe e S, 4) omeostasi cellulare del calcio intracellulare, 5) risposta immunitaria, sia innata che acquisita, e 6) regolazione di alcuni tipi di apoptosi.

Le cellule reagiscono continuamente ai cambiamenti ambientali a cui sono esposte. In situazioni di stress cellulare (es. deprivazione calorica, mancanza di nutrienti specifici, sbalzi di temperatura, ecc.) il nucleo cellulare reagisce inviando segnali ai mitocondri affinché modifichino la loro funzione per adattarsi al cambiamento (segnalazione anterograda dal nucleo ai mitocondri: ad esempio l'esercizio fisico consuma ATP nella cellula muscolare, che attiva l'AMPK, che attiva il cofattore di trascrizione nucleare PGC-1alpha, che a sua volta attiva OXPOS/ETC e la biogenesi mitocondriale). D'altra parte, quando c'è una situazione stressante nei mitocondri stessi (ad es. produzione eccessiva di radicali liberi dell'ossigeno, proteine ​​intramitocondriali dispiegate, ecc.) vengono inviati segnali al nucleo affinché modifichi la produzione di proteine ​​destinate a prevenire/correggere il danno mitocondriale, inclusi chaperoni, antiossidanti o enzimi proteolitici proteolitici (segnalazione retrograda autonoma o intracellulare) .

Recentemente è stato dimostrato che i mitocondri sono in grado di generare direttamente o indirettamente peptidi che non solo influenzano la propria cellula che li produce, ma hanno effetti a distanza (segnalazione retrograda non autonoma o extracellulare). Queste sostanze, scoperte dal gruppo di Dillin, sono chiamate mitochine e inviano segnali dai tessuti con i mitocondri stressati a tutto il corpo, essendo ormoni che preparano l'intero organismo a rispondere allo stress cellulare a cui sarà sottoposto.

Le mitochine vengono rilasciate in presenza di qualsiasi tipo di stress mitocondriale (mutazioni congenite o acquisite nel mtDNA, disturbi dell'OXPHOS/ETC che generano stress ossidativo, tossine mitocondriali, ecc.). Nei mammiferi lo stress mitocondriale è generalmente associato alla cosiddetta risposta cellulare integrata allo stress (ICRS)". Uno dei meccanismi più importanti dell'ICRS è l'UPR (Unfolded protein response), in cui i mitocondri partecipano in modo coordinato con il sistema del reticolo endoplasmatico e il nucleo cellulare.

Esistono almeno due diversi tipi di mitochine: 1) mitochine primarie, codificate nel DNA mitocondriale (mtDNA) e 2) mitochine secondarie, codificate nel DNA del nucleo (nDNA), la cui secrezione è regolata attraverso segnali di attivazione dai mitocondri stressati al nDNA (ad es. ATF4, ecc.). Humanin (HN), MOTS-c (Mitochondrial ORF of the Twelve S-c) e sei peptidi simili all'umanina (SHLP 1-6) sono considerati mitochine primarie, sebbene il numero possa essere più alto. Fino a poco tempo fa, si pensava che il DNA mitocondriale codificasse solo 37 geni (13 peptidi trovati esclusivamente nei mitocondri, tutti sottounità dell'ETC, 22 RNA di trasferimento -tRNA- e 2 RNA ribosomiali -rRNA-) RNA. Ora sappiamo che l'rRNA 16s e 12s contiene sORF ("brevi frame di lettura aperti") che traducono peptidi secretori da 20-30 aa. Non è noto quali meccanismi intimi regolino la sintesi e il rilascio di queste mitochine, sebbene sia possibile che siano correlati a un'attivazione ribosomiale mitocondriale. Per quanto riguarda le mitochine secondarie (quelle codificate nel DNA nucleare) sotto l'attivazione di ATF4 conosciamo il fattore di crescita fibroblastico 21 (FGF21), il fattore di crescita e sviluppo 15 (MIC1/GDF15), la follistatina e l'intermedina-adrenomedullina2. Queste mitochine rispondono anche ad altri stimoli, indipendenti dai mitocondri.

Humanin è un peptide di 21 o 24 aa, con molteplici funzioni citoprotettive contro il danno mitocondriale (aumenta la sintesi di antiossidanti e chaperoni per 4 proteine ​​non ripiegate). È antinfiammatorio (abbassa le citochine infiammatorie e aumenta le citochine antinfiammatorie) e antiapoptotico (blocca fattori apoptotici come Bak e IGFBP3), attraverso almeno 2 recettori di membrana e diverse interazioni con altre proteine ​​intracellulari ed extracellulari, in molti tessuti (sistema nervoso, fegato, cuore, parete vascolare, muscolo scheletrico, epitelio pigmentato retinico, gonadi ecc.). Ha anche effetti metabolici benefici (diminuisce la resistenza all'insulina a livello centrale, protegge la cellula beta pancreatica dallo stress ossidativo e ha un feedback negativo con IGF1). Recentemente è stato dimostrato che le persone con alti livelli di questo ormone hanno meno decadimento cognitivo con l'età e sono anche molto longeve.

MOTS-c è un altro piccolo peptide di 16 aa, codificato dal mtDNA, ma sintetizzato esclusivamente nei ribosomi citosolici, che ha anche benefici effetti antiossidanti e metabolici, in quanto diminuisce la resistenza all'insulina e previene l'obesità. D'altra parte, aumenta la resistenza contro alcune infezioni, aumenta e diminuisce il riassorbimento osseo, quindi può avere effetti antiosteoporotici. Entrambi gli ormoni sono misurabili nel sangue mediante ELISA, sebbene vi siano alcune discrepanze nei loro livelli plasmatici a seconda del test utilizzato.

FGF21 è un ormone ben caratterizzato che stimola la chetogenesi e la beta ossidazione degli acidi grassi. La sua secrezione è regolata dal digiuno e dall'attivazione dei recettori PPAR-α, ma è anche noto che aumenta in qualsiasi situazione di stress mitocondriale che attiva i segnali mitocondriali-nucleo. Il MIC1/GDF15 è un altro ormone circolante che riduce la fame, attivando un livello di recettore specifico (GFRAL) presente nell'area postrema e nel nucleo del tratto solitario. Livelli elevati di GDF15 sono stati trovati nella cachessia tumorale e in molte altre situazioni, tra cui la BPCO. Viene anche rilasciato quando vengono attivati ​​​​i segnali mitocondriali-nucleo. Nella BPCO, di tutte le mitochine qui esaminate, ci sono solo informazioni sui livelli ematici di GDF15, ma non ci sono dati in letteratura sui livelli delle altre mitochine. Con il progredire della BPCO, è probabile che i livelli ematici delle mitochine aumentino progressivamente, esprimendo un ulteriore deterioramento della funzione mitocondriale, sebbene i loro livelli possano aumentare solo fino a un certo livello, per poi diminuire quando il danno mitocondriale è insopportabile, costituendo così una sorta di risposta mitoormetica. IPOTESI Le mitochine, espresse nel contesto della disfunzione mitocondriale, sono alterate nei pazienti con BPCO e sono associate ai peggiori esiti clinici. Inoltre, le mitochine possono essere utilizzate come fattori prognostici e potenziali bersagli terapeutici nella BPCO. OBIETTIVI

1. - Descrivere i livelli di mitochine in un gruppo di controllo, un gruppo di pazienti ambulatoriali con BPCO stabile e un gruppo di pazienti con BPCO esacerbata.
2. - Descrivere le differenze nei livelli di semitoni in diversi gruppi di pazienti con BPCO (diversi livelli di ostruzione, pazienti con alto rischio di esacerbazione rispetto a nessun rischio di esacerbazione, pazienti con punteggio CAT <10 rispetto al resto dei pazienti, pazienti con basso Indice di massa (FFMI) rispetto al resto dei pazienti).
3. -Valutare la correlazione tra semitoni e diversi esiti clinici come FFMI, distanza percorsa nel test del cammino di 6 minuti, FEV1, punteggio CAT.
4. - Valutare se le mitochine possono essere utilizzate per prevedere il rischio futuro di riacutizzazione e ricovero ospedaliero.

METODI

Popolazione di studio

Criteri di inclusione ed esclusione:

Pazienti stabili con BPCO: saranno selezionati dagli ambulatori di Pneumologia dell'Ospedale

Universitario Marqués de Valdecilla. I pazienti con BPCO devono soddisfare i seguenti criteri:

40 anni o più con volume espiratorio forzato al basale post-broncodilatatore in 1 s [FEV1]/capacità vitale forzata [FVC] ≤0,70.

Pazienti con BPCO esacerbato: saranno selezionati tra i pazienti ricoverati presso l'Ospedale Universitario Marqués de Valdecilla con la diagnosi di esacerbazione della BPCO.

Gruppo di controllo: sarà ottenuto da pazienti senza BPCO o qualsiasi altra condizione respiratoria acuta o cronica e parenti dei pazienti.

Accettando un rischio alfa di 0,05 e un rischio beta di 0,2 nel test a due code sono necessari 30 soggetti nel primo gruppo e 90 nel secondo per trovare una differenza proporzionale statisticamente significativa che dovrebbe essere di 0,45 nel gruppo 1 e 0,1 nel gruppo 2 Prevedendo un tasso di abbandono del 5%. L'approssimazione ARCSINO. Questo calcolo è stato eseguito in base a studi precedentemente pubblicati eseguiti dal nostro gruppo. Calcoliamo una dimensione semplice di 120 pazienti con BPCO, 30 pazienti con riacutizzazione della BPCO e 30 controlli.

Arruolamento target/dimensione del campione 180 Tasso di arruolamento previsto 25 pazienti al mese Data stimata di inizio dello studio: Campioni raccolti in Biobanca dal 01.12.2019 Campioni inviati al laboratorio di biochimica 01.03.2020 Data stimata di completamento dello studio: (fine del follow-up) 05.04.2021 Disegno e metodi dello studio Studio prospettico osservazionale. I pazienti saranno reclutati da cliniche ambulatoriali per la BPCO, cliniche ambulatoriali per la cessazione del fumo e da pazienti ricoverati in ospedale a causa di riacutizzazione della BPCO. A tutti i pazienti verrà dato il consenso informato scritto alla partecipazione. Questo studio è stato già approvato dal Comitato Etico della Cantabria (CEIC).

Partecipanti

1. BPCO stabile (40 anni o più con volume espiratorio forzato post-broncodilatatore al basale in 1 s [FEV1]/capacità vitale forzata [FVC] ≤0,70) saranno reclutati durante il loro regolare follow-up.
2. Gruppo di controllo: volontari di pari età e sesso senza precedente diagnosi di BPCO o altre condizioni respiratorie e con volume espiratorio forzato post-broncodilatatore in 1 s [FEV1]/capacità vitale forzata [FVC] >0,70.
3. Pazienti con BPCO esacerbata: pazienti con precedente diagnosi di BPCO (40 anni o più con volume espiratorio forzato al basale post-broncodilatatore in 1 s [FEV1]/capacità vitale forzata [FVC] ≤0,70) ricoverati nel reparto di pneumologia dell'ospedale a causa di riacutizzazione della BPCO.

L'indice di comorbilità di Charlson verrà registrato da tutti i partecipanti allo studio. Pazienti con riacutizzazioni acute 1 mese prima dello studio, pazienti inclusi in riabilitazione polmonare durante lo studio o 6 mesi prima del periodo di inclusione, con altre potenziali cause di sarcopenia (malattie maligne, insufficienza cardiaca, ipertiroidismo o altre malattie croniche devastanti) e pazienti con malattie renali croniche note o lesioni renali acute recenti saranno escluse dallo studio. I campioni di sangue e tutte le altre misurazioni verranno effettuati lo stesso giorno in cui i pazienti accettano di entrare nello studio.

Caratteristiche cliniche

Al momento dell'arruolamento nello studio, i pazienti con BPCO saranno suddivisi in diversi gruppi categorici: (1) pazienti non sintomatici (punteggio del test di valutazione della BPCO [CAT] <10) rispetto a pazienti sintomatici (punteggio CAT ≥10), (2) pazienti non dispnoici (punteggio di dispnea modificato dal Medical Research Council [mMRC] < 2) rispetto ai pazienti dispnoici (mMRC ≥2), pazienti ad alto rischio di riacutizzazioni (quelli con 2 o più riacutizzazioni che richiedono un trattamento con antibiotici o steroidi sistemici o almeno un ricovero ospedaliero nel precedente anno) rispetto a pazienti a basso rischio di riacutizzazione e (4) ex fumatori rispetto a fumatori attivi. Dopo essere entrati nello studio, verranno prelevati campioni di sangue e i pazienti saranno seguiti per 1 anno (una visita dopo 6 mesi e una visita dopo 12 mesi) e le riacutizzazioni e i ricoveri ospedalieri saranno registrati in modo prospettico. Durante il periodo di follow-up, tutti i ricercatori clinici nello studio saranno all'oscuro dei risultati delle mitochine. Durante questo periodo, i pazienti con possibili riacutizzazioni polmonari saranno istruiti a recarsi liberamente al Pronto Soccorso dell'Ospedale e quell'équipe di medici deciderà liberamente se ricoverarli o meno, secondo i propri criteri clinici.

In base ai livelli di mitochine i pazienti saranno divisi in due gruppi: uno composto da quelli all'interno del più alto quartile delle mitochine e l'altro gruppo includerà i pazienti negli altri tre quartili dei livelli di mitochine.

Misurazioni La dispnea basale sarà registrata utilizzando la scala di dispnea mMRC. Il punteggio CAT verrà registrato mediante questionario autosomministrato. Le precedenti riacutizzazioni saranno registrate dalle cartelle cliniche dei pazienti inclusi nello studio. La spirometria sarà misurata secondo l'American Thoracic Society/European Respiratory Society (ATS/ERS) in tutti i soggetti.

La composizione corporea sarà stimata da un dispositivo di impedenza bioelettrica (OMROM BF511, Omrom, Giappone) e la FFMI sarà calcolata come rapporto tra la FFM e l'altezza in metri quadrati. Il test del cammino di 6 minuti verrà eseguito secondo il protocollo dell'American Thoracic Society: ai pazienti è stato chiesto di camminare il più lontano possibile in 6 minuti in un corridoio rettilineo di 30 m senza alcuna interruzione. Al termine del test verrà registrata la distanza percorsa dai pazienti e la dispnea. Humanina e MOTS-c saranno misurati mediante ELISA (Mybiosource), FGF21 e GDF15. Sarà misurato mediante ELISA (Quantikine). Se possibile Romo1 sarà misurato anche mediante ELISA. Lo studio sarà suddiviso in 3 visite: VISITA 1: Prelievo di sangue e caratteristiche cliniche. VISITA 2: 6 mesi dopo la visita 1: Riacutizzazioni e ricoveri (numero e data) dopo la visita 1. VISITA 3: 12 mesi dopo la visita 1: Riacutizzazioni e ricoveri (numero e data) dopo la visita 2.

Endpoint dello studio Endpoint primario: le mitochine possono essere utilizzate per stimare il rischio di ricovero ospedaliero nei pazienti con BPCO.

Endpoint secondari:

1. -Le mitochine possono essere utilizzate per stimare il rischio di riacutizzazione della BPCO nei pazienti con BPCO.
2. - Le mitochine sono alterate nei pazienti con BPCO.
3. - Le mitochine sono alterate nelle riacutizzazioni della BPCO.
4. - Le mitochine correlano con diverse variabili della BPCO (FEV1, FFMI..).

Piano statistico o analisi dei dati I dati saranno presentati come media ± DS per dati normalmente distribuiti o mediana (intervallo interquartile) per dati non parametrici. Le differenze tra i gruppi saranno analizzate utilizzando test t non appaiati per dati parametrici o test di Mann-Whitney per dati non parametrici.

Le correlazioni tra i set di dati sono state esaminate utilizzando il coefficiente di correlazione di Pearson (r) per i dati parametrici o il coefficiente di correlazione del rango di Spearman (rs) per i dati non parametrici. La distribuzione normale sarà testata utilizzando un test di Kolmogorov-Smirnov.

Le stime di Kaplan-Meier verranno utilizzate per calcolare la proporzione di partecipanti che hanno un evento nel tempo. L'analisi univariata e multivariata utilizzando l'analisi del rischio proporzionale di Cox verrà eseguita utilizzando il software SPSS versione 25.00 per PC per analizzare lo sviluppo dei primi eventi in base ai livelli basali di mitochine e per identificare i fattori di rischio associati alle riacutizzazioni e all'ospedalizzazione. Le differenze saranno considerate significative se i valori di p fossero inferiori a 0,05. Tutti i valori p riportati saranno bilaterali.

Limitazioni e considerazioni etiche Trattandosi di uno studio monocentrico, deve essere replicato in studi multicentrici, utilizzando un numero maggiore di pazienti provenienti da paesi diversi. Sebbene costose e complicate, alcune tecniche come la biopsia muscolare, l'ergometria, la quantificazione della massa muscolare mediante TC o il test navetta potrebbero essere eseguite per avere una migliore visione d'insieme della massa muscolare e della funzione in questi pazienti.

Da questo studio non si prevede alcun danno potenziale per i pazienti. Questo studio è stato approvato dal comitato etico della Cantabria (Codice: :2018.276). Sebbene lo studio sia finanziato dalla società GlaxoSmithKline (GSK), si tratta di uno studio indipendente e gli investigatori non ricevono alcun compenso finanziario.