Mitochiny w POChP

WPROWADZENIE Przewlekła obturacyjna choroba płuc (POChP) charakteryzuje się postępującą i trudno odwracalną obturacją dróg oddechowych, która dotyczy głównie małych dróg oddechowych (przewlekłe obturacyjne zapalenie oskrzelików), zmiennie związanej z destrukcją miąższu płucnego (rozedmą płuc). 10% osób w wieku powyżej 45 lat choruje na POChP. Przewiduje się, że do 2020 roku POChP będzie trzecią najczęstszą przyczyną zgonów na świecie. Główną przyczyną POChP w krajach zachodnich jest przewlekły kontakt dymu tytoniowego z drogami oddechowymi, z masowym przedostawaniem się do organizmu wielu toksycznych substancji i reaktywnych form tlenu (ROS), które indukują stres oksydacyjny (OS). OS w POChP jest zarówno egzogenne (ROS wdychane), jak i endogenne (ROS indukowane przez toksyczność tytoniu i własną chorobę). Niektórzy badacze uważają, że OS w POChP jest ściśle związane ze szczególnym rodzajem przyspieszonego starzenia się komórek, związanego z przewlekłym procesem zapalnym, który dotyczy nie tylko układu oddechowego, ale także wielu innych części ciała (mięśnie szkieletowe, układ sercowo-naczyniowy, globalny metabolizm). , system immunologiczny itp.).

Dysfunkcja mitochondriów odgrywa główną, ale nie wyłączną, rolę w stresie oksydacyjnym, starzeniu się komórek i przewlekłym zapaleniu. Dlatego lepsze zrozumienie dysfunkcji mitochondriów leżących u podstaw POChP umożliwiłoby lepsze zrozumienie fizjopatologii i zidentyfikowanie nowych możliwych celów terapeutycznych. Zmiany mitochondrialne POChP w obszarach oskrzelowo-płucnym, mięśniowym i immunologicznym są szeroko udokumentowane zarówno pod względem morfologicznym, jak i patofizjologicznym. Dysfunkcja mitochondriów może być pierwotna (wrodzona) lub wtórna (nabyta, jak w przypadku palenia tytoniu). Jest to szerokie pojęcie obejmujące upośledzoną produkcję energii komórkowej, nadmierne wytwarzanie ROS lub niektórych metabolitów z cyklu Krebsa w mitochondriach oraz utratę kontroli jakości istotnych składników mitochondrialnych, co ostatecznie prowadzi do nieprawidłowej produkcji cząsteczek wewnątrzmitochondrialnych (mtDNA, ATP, cytochrom c, Romo1 itp.) do cytozolu i płynów zewnątrzkomórkowych. Niektóre z tych cząsteczek zachowują się jak DAMP (wzorce molekularne związane z uszkodzeniami) i indukują aktywację wrodzonej odporności, a tym samym stan zapalny. Poziomy cytochromu C i Romo1 we krwi zostały zaproponowane jako markery stresu oksydacyjnego. Główną funkcją mitochondriów jest wytwarzanie ATP, podstawowej cząsteczki przenoszącej energię potrzebnej do utrzymania żywej komórki. Wytwarzanie ATP jest wytwarzane z innych prekursorów energii w mitochondriach poprzez system fosforylacji oksydacyjnej sprzężony z łańcuchem transportu elektronów (OXPHOS/ETC). Te organelle odgrywają również fundamentalną rolę w 1) wytwarzaniu specyficznych metabolitów węglowodanów, lipidów i białek, które są niezbędne dla wielu funkcji komórkowych, 2) syntezie hemów i hormonów steroidowych, 3) zarządzaniu „skupiskami” Fe i S, 4) homeostaza komórkowa wapnia wewnątrzkomórkowego, 5) odpowiedź immunologiczna, zarówno wrodzona, jak i nabyta, oraz 6) regulacja niektórych typów apoptozy.

Komórki nieustannie reagują na zmiany środowiskowe, na które są narażone. W sytuacjach stresu komórkowego (np. niedobór kalorii, brak określonych składników odżywczych, zmiany temperatury itp.) jądro komórkowe reaguje wysyłając sygnały do ​​mitochondriów, aby zmodyfikowały one swoją funkcję, aby dostosować się do zmiany (sygnalizacja wsteczna z jądra do mitochondriów: na przykład ćwiczenia fizyczne zużywają ATP w komórce mięśniowej, który aktywuje AMPK, który aktywuje jądrowy kofaktor transkrypcji PGC-1alfa, co z kolei aktywuje OXPOS/ETC i biogenezę mitochondriów). Z drugiej strony, gdy w samych mitochondriach dochodzi do stresującej sytuacji (np. nadmierna produkcja wolnych rodników tlenowych, niesfałdowanych białek wewnątrzmitochondrialnych itp.) do jądra wysyłane są sygnały w celu modyfikacji produkcji białek, które mają zapobiegać/naprawiać uszkodzenia mitochondriów, w tym białek opiekuńczych, przeciwutleniaczy lub enzymów proteolitycznych proteolityczne (autonomiczna lub wewnątrzkomórkowa sygnalizacja wsteczna) .

Niedawno wykazano, że mitochondria są zdolne do bezpośredniego lub pośredniego generowania peptydów, które nie tylko wpływają na własną komórkę, która je wytwarza, ale mają również wpływ na odległość (nieautonomiczna lub zewnątrzkomórkowa sygnalizacja wsteczna). Substancje te, odkryte przez grupę Dillina, nazywane są mitochinami i wysyłają sygnały z tkanek z zestresowanymi mitochondriami do całego organizmu, będąc hormonami, które przygotowują cały organizm do odpowiedzi na stres komórkowy, któremu zostanie poddany.

Mitochiny są uwalniane, gdy występuje jakikolwiek stres mitochondrialny (wrodzone lub nabyte mutacje w mtDNA, zaburzenia OXPHOS/ETC, które generują stres oksydacyjny, toksyny mitochondrialne itp.). U ssaków stres mitochondrialny jest na ogół związany z tak zwaną zintegrowaną odpowiedzią komórkową na stres (ICRS)”. Jednym z najważniejszych mechanizmów ICRS jest UPR (ang. Unfolded protein response), w którym mitochondria uczestniczą w skoordynowany sposób z systemem retikulum endoplazmatycznego i jądrem komórkowym.

Istnieją co najmniej dwa różne rodzaje mitochin: 1) mitochiny pierwotne, zakodowane w mitochondrialnym DNA (mtDNA) i 2) mitokiny wtórne, zakodowane w DNA jądra komórkowego (nDNA), których wydzielanie jest regulowane przez sygnały aktywacyjne z mitochondriów poddanych stresowi do nDNA (np. ATF4 itp.). Humanina (HN), MOTS-c (Mitochondrial ORF of the Twelve S-c) i sześć peptydów podobnych do humaniny (SHLP 1-6) są uważane za podstawowe mitochiny, chociaż ich liczba może być wyższa. Do niedawna uważano, że mitochondrialne DNA koduje tylko 37 genów (13 peptydów występujących wyłącznie w mitochondriach, wszystkie z nich są podjednostkami ETC, 22 przenoszące RNA -tRNA- i 2 rybosomalne RNA -rRNA-) RNA. Teraz wiemy, że 16s i 12s rRNA zawierają sORF („krótkie otwarte ramki odczytu”), które tłumaczą peptydy wydzielnicze z 20-30 aa. Nie wiadomo, jakie intymne mechanizmy regulują syntezę i uwalnianie tych mitochin, chociaż możliwe jest, że są one związane z mitochondrialną aktywacją rybosomów. Jeśli chodzi o mitochiny wtórne (te zakodowane w jądrowym DNA) pod wpływem aktywacji ATF4, znamy czynnik wzrostu fibroblastów 21 (FGF21), czynnik wzrostu i rozwoju 15 (MIC1/GDF15), folistatynę i intermedynę-adrenomedulinę2. Te mitochiny reagują również na inne bodźce, niezależne od mitochondriów.

Humanina jest peptydem o długości 21 lub 24 aminokwasów, pełniącym wiele funkcji cytoochronnych przed uszkodzeniem mitochondriów (zwiększa syntezę przeciwutleniaczy i białek opiekuńczych dla 4 niesfałdowanych białek). Działa przeciwzapalnie (obniża cytokiny zapalne i podnosi cytokiny przeciwzapalne) i antyapoptotycznie (blokuje czynniki apoptotyczne, takie jak Bak i IGFBP3), poprzez co najmniej 2 receptory błonowe i kilka interakcji z innymi białkami wewnątrzkomórkowymi i zewnątrzkomórkowymi w wielu tkankach (układ nerwowy, wątroba, serce, ściany naczyń, mięśnie szkieletowe, nabłonek barwnikowy siatkówki, gonady itp.). Ma również korzystne działanie metaboliczne (zmniejsza oporność na insulinę na poziomie centralnym, chroni komórki beta trzustki przed stresem oksydacyjnym oraz wykazuje ujemne sprzężenie zwrotne z IGF1). Ostatnio udowodniono, że osoby z wysokim poziomem tego hormonu mają z wiekiem mniejsze zaburzenia funkcji poznawczych i są również bardzo długowieczne.

MOTS-c to kolejny mały peptyd o długości 16 aa, kodowany mtDNA, ale syntetyzowany wyłącznie w rybosomach cytozolowych, który ma również korzystne działanie antyoksydacyjne i metaboliczne, ponieważ zmniejsza oporność na insulinę i zapobiega otyłości. Z drugiej strony zwiększa odporność na niektóre infekcje, zwiększa i zmniejsza resorpcję kości, więc może działać przeciw osteoporozie. Oba hormony są mierzalne we krwi za pomocą testu ELISA, chociaż istnieją pewne rozbieżności w ich poziomach w osoczu w zależności od zastosowanego testu.

FGF21 jest dobrze scharakteryzowanym hormonem, który stymuluje ketogenezę i beta-oksydację kwasów tłuszczowych. Jego wydzielanie jest regulowane przez post i aktywację receptorów PPAR-α, ale wiadomo również, że wzrasta w każdej sytuacji stresu mitochondrialnego, który aktywuje sygnały mitochondria-jądro. MIC1/GDF15 to kolejny krążący hormon, który zmniejsza głód, aktywując określony poziom receptora (GFRAL) znajdujący się w obszarze postremy i jądrze pasma samotnego. Podwyższony poziom GDF15 stwierdzono w kacheksji nowotworowej iw wielu innych sytuacjach, między innymi w POChP. Jest również uwalniany, gdy aktywowane są sygnały mitochondrialne do jądra. W przypadku POChP spośród wszystkich omawianych tu mitochin dostępne są tylko informacje dotyczące poziomów GDF15 we krwi, ale w literaturze nie ma danych dotyczących poziomów innych mitochin. W miarę postępu POChP poziom mitochin we krwi prawdopodobnie będzie stopniowo wzrastał, wyrażając dalsze pogorszenie funkcji mitochondriów, chociaż ich poziom może wzrastać tylko do pewnego poziomu, a następnie spadać, gdy uszkodzenie mitochondriów jest nie do zniesienia, stanowiąc w ten sposób rodzaj odpowiedzi mitohormetycznej. HIPOTEZA Mitochiny, wyrażane w kontekście dysfunkcji mitochondriów, są zmienione u chorych na POChP i wiążą się z najgorszymi wynikami klinicznymi. Ponadto mitochiny mogą być stosowane jako czynniki prognostyczne i potencjalne cele terapeutyczne w POChP. CELE

1. - Opisanie poziomów mitochin w grupie kontrolnej, grupie chorych na POChP w stanie stabilnym oraz grupie chorych na POChP w stanie zaostrzenia.
2. - Opisanie różnic w poziomach półtonów w różnych grupach chorych na POChP (różne stopnie obturacji, pacjenci z dużym ryzykiem zaostrzenia vs. bez ryzyka zaostrzenia, pacjenci z wynikiem CAT <10 vs pozostali pacjenci, pacjenci z niskim wskaźnik masy (FFMI) vs. reszta pacjentów).
3. -Aby ocenić korelację między półtonami a różnymi wynikami klinicznymi, takimi jak FFMI, przebyty dystans w 6-minutowym teście marszu, FEV1, wynik CAT.
4. - Aby ocenić, czy mitochiny można wykorzystać do przewidywania przyszłego ryzyka zaostrzenia i przyjęcia do szpitala.

METODY

Badana populacja

Kryteria włączenia i wyłączenia:

Stabilni pacjenci z POChP: zostaną wybrani z poradni pulmonologicznych ze Szpitala

Universitario Marques de Valdecilla. Pacjenci z POChP muszą spełniać następujące kryteria:

40 lat lub więcej z wyjściową natężoną objętością wydechową po podaniu leku rozszerzającego oskrzela w ciągu 1 s [FEV1]/natężoną pojemność życiową [FVC] ≤0,70.

Pacjenci z zaostrzeniem POChP: Zostaną wybrani spośród pacjentów przyjętych do szpitala Universitario Marqués de Valdecilla z rozpoznaniem zaostrzenia POChP.

Grupa kontrolna: zostanie pozyskana od pacjentów bez POChP lub innych ostrych lub przewlekłych chorób układu oddechowego oraz krewnych pacjentów.

Przyjmując ryzyko alfa 0,05 i ryzyko beta 0,2 w teście dwustronnym, potrzeba 30 osób w pierwszej grupie i 90 w drugiej, aby znaleźć statystycznie istotną różnicę proporcji, która ma wynieść 0,45 w grupie 1 i 0,1 w grupie 2 Przewidując wskaźnik rezygnacji na poziomie 5%. Przybliżenie ARCSINUS. To obliczenie zostało przeprowadzone zgodnie z wcześniej opublikowanymi badaniami przeprowadzonymi przez naszą grupę. Obliczamy prosty rozmiar 120 pacjentów z POChP, 30 pacjentów z zaostrzeniem POChP i 30 osób z grupy kontrolnej.

Docelowa rekrutacja/liczba próby 180 Przewidywany wskaźnik rekrutacji 25 pacjentów miesięcznie Przewidywana data rozpoczęcia badania: Próbki pobierane w Biobanku od 01.12.2019 Próbki wysłane do laboratorium biochemicznego 01.03.2020 Przewidywana data zakończenia badania: (zakończenie obserwacji) 05.04.2021 Projekt badania i metody Prospektywne badanie obserwacyjne. Pacjenci będą rekrutowani z poradni POChP, poradni rzucania palenia oraz spośród pacjentów hospitalizowanych z powodu zaostrzenia POChP. Wszyscy pacjenci otrzymają pisemną świadomą zgodę na udział. Badanie to zostało już zatwierdzone przez Komisję Etyki Kantabrii (CEIC).

Uczestnicy

1. Stabilna POChP (40 lat lub więcej z wyjściową natężoną objętością wydechową po podaniu leku rozszerzającego oskrzela w ciągu 1 s [FEV1]/natężoną pojemnością życiową [FVC] ≤0,70) zostanie zwerbowana podczas ich regularnej obserwacji.
2. Grupa kontrolna: dobrani pod względem wieku i płci ochotnicy bez wcześniejszej diagnozy POChP lub innych chorób układu oddechowego, z natężoną objętością wydechową po podaniu leku rozszerzającego oskrzela w ciągu 1 s [FEV1]/natężoną pojemnością życiową [FVC] >0,70.
3. Pacjenci z zaostrzeniem POChP: Pacjenci z wcześniejszym rozpoznaniem POChP (40 lat lub starsi z wyjściową natężoną objętością wydechową po podaniu leku rozszerzającego oskrzela w czasie 1 s [FEV1]/natężoną pojemnością życiową [FVC] ≤0,70) przyjęci do szpitalnego oddziału pulmonologii z powodu zaostrzenia POChP.

Charlson Comorbidity Index zostanie zarejestrowany od wszystkich uczestników badania. Pacjenci z ostrymi zaostrzeniami na 1 miesiąc przed badaniem, pacjenci objęci rehabilitacją oddechową w trakcie badania lub 6 miesięcy przed okresem włączenia, z innymi potencjalnymi przyczynami sarkopenii (choroby nowotworowe, niewydolność serca, nadczynność tarczycy lub inne przewlekłe choroby wyniszczające) oraz pacjenci z znane przewlekłe choroby nerek lub niedawno przebyta ostra niewydolność nerek zostaną wykluczone z badania. Próbki krwi i wszystkie inne pomiary zostaną wykonane tego samego dnia, w którym pacjenci wyrażą zgodę na udział w badaniu.

Charakterystyka kliniczna

Podczas włączania do badania pacjenci z POChP zostaną podzieleni na różne kategorie: (1) pacjenci bez objawów (wynik POChP Assessment Test [CAT] < 10) kontra pacjenci z objawami (wynik CAT ≥10), (2) pacjenci bez duszności (zmodyfikowana ocena duszności według Medical Research Council [mMRC] < 2) w porównaniu z pacjentami z dusznością (mMRC ≥2), pacjenci z dużym ryzykiem zaostrzeń (osoby z 2 lub więcej zaostrzeniami wymagającymi leczenia antybiotykami lub steroidami ogólnoustrojowymi lub co najmniej jedną hospitalizacją w poprzednim rok) w porównaniu z pacjentami z niskim ryzykiem zaostrzenia oraz (4) byli palacze w porównaniu z aktywnymi palaczami. Po włączeniu do badania zostaną pobrane próbki krwi, a pacjenci będą obserwowani przez 1 rok (jedna wizyta po 6 miesiącach i jedna wizyta po 12 miesiącach), a zaostrzenia i hospitalizacje będą rejestrowane prospektywnie. W okresie obserwacji wszyscy badacze kliniczni biorący udział w badaniu będą zaślepieni na wyniki mitochin. W tym okresie pacjenci z możliwymi zaostrzeniami płucnymi zostaną poinstruowani o swobodnym zgłaszaniu się na SOR Szpitala i ten zespół lekarzy będzie swobodnie decydował o ich hospitalizacji lub nie, według własnych kryteriów klinicznych.

W zależności od poziomów mitochin pacjenci zostaną podzieleni na dwie grupy: jedna złożona z tych z najwyższego kwartyla mitochin, a druga grupa będzie obejmowała pacjentów z pozostałych trzech kwartyli poziomów mitochin.

Pomiary Podstawowa duszność zostanie zarejestrowana przy użyciu skali duszności mMRC. Wynik CAT zostanie odnotowany za pomocą samodzielnie wypełnionego kwestionariusza. Wcześniejsze zaostrzenia zostaną odnotowane na podstawie dokumentacji klinicznej pacjentów włączonych do badania. Spirometria będzie mierzona zgodnie z zaleceniami American Thoracic Society/European Respiratory Society (ATS/ERS) u wszystkich pacjentów.

Skład ciała zostanie oszacowany za pomocą urządzenia do impedancji bioelektrycznej (OMROM BF511, Omrom, Japonia), a FFMI zostanie obliczony jako stosunek FFM do wzrostu w metrach do kwadratu. Test 6-minutowego marszu zostanie przeprowadzony zgodnie z protokołem Amerykańskiego Towarzystwa Chorób Klatki Piersiowej: pacjenci mieli przejść jak najdalej w ciągu 6 minut 30-metrowym prostym korytarzem bez żadnych przerw. Na koniec testu rejestrowany będzie dystans przebyty przez pacjentów oraz duszność. Humanina i MOTS-c będą mierzone metodą ELISA (Mybiosource), FGF21 i GDF15. Zostanie zmierzony za pomocą testu ELISA (Quantikine). Jeśli to możliwe, Romo1 będzie mierzone również metodą ELISA. Badanie zostanie podzielone na 3 wizyty: WIZYTA 1: Pobranie próbki krwi i charakterystyka kliniczna. WIZYTA 2: 6 miesięcy po wizycie 1: Zaostrzenia i hospitalizacje (liczba i data) po wizycie 1. WIZYTA 3: 12 miesięcy po wizycie 1: Zaostrzenia i hospitalizacje (liczba i data) po wizycie 2.

Punkty końcowe badania Pierwszorzędowy punkt końcowy: Mitochiny można wykorzystać do oszacowania ryzyka przyjęcia do szpitala u pacjentów z POChP.

Drugorzędowe punkty końcowe:

1. - Mitochiny można wykorzystać do oszacowania ryzyka zaostrzenia POChP u chorych na POChP.
2. - Mitochiny są zmienione u pacjentów z POChP.
3. - Mitochiny ulegają zmianie w zaostrzeniach POChP.
4. - Mitochiny korelują z różnymi zmiennymi POChP (FEV1, FFMI..).

Plan statystyczny lub analiza danych Dane zostaną przedstawione jako średnia ± SD dla danych o rozkładzie normalnym lub jako mediana (rozstęp międzykwartylowy) dla danych nieparametrycznych. Różnice między grupami zostaną przeanalizowane za pomocą testów t niesparowanych dla danych parametrycznych lub testów Manna-Whitneya dla danych nieparametrycznych.

Korelacje między zestawami danych badano za pomocą współczynnika korelacji Pearsona (r) dla danych parametrycznych lub współczynnika korelacji rang Spearmana (rs) dla danych nieparametrycznych. Rozkład normalny zostanie przetestowany za pomocą testu Kołmogorowa-Smirnowa.

Szacunki Kaplana-Meiera zostaną wykorzystane do obliczenia odsetka uczestników, którzy mają wydarzenie w czasie. Analiza jednoczynnikowa i wieloczynnikowa z wykorzystaniem proporcjonalnej analizy ryzyka Coxa zostanie przeprowadzona przy użyciu oprogramowania SPSS w wersji 25.00 na komputery PC w celu przeanalizowania rozwoju pierwszych zdarzeń zgodnie z podstawowymi poziomami mitochin oraz w celu zidentyfikowania czynników ryzyka związanych z zaostrzeniami i hospitalizacją. Różnice będą uważane za znaczące, jeśli wartości p będą mniejsze niż 0,05. Wszystkie zgłoszone wartości p będą dwustronne.

Ograniczenia i względy etyczne Jest to badanie jednoośrodkowe, dlatego należy je powtórzyć w badaniach wieloośrodkowych z udziałem większej liczby pacjentów pochodzących z różnych krajów. Chociaż drogie i skomplikowane, niektóre techniki, takie jak biopsja mięśnia, ergometria, masa mięśniowa określana ilościowo za pomocą CT lub testu wahadłowego, mogą być wykonane w celu uzyskania lepszego przeglądu masy i funkcji mięśni u tych pacjentów.

W wyniku tego badania nie oczekuje się potencjalnej szkody dla pacjentów. Badanie to zostało zatwierdzone przez komisję etyczną Kantabrii (Kod: 2018.276). Chociaż badanie jest finansowane przez firmę GlaxoSmithKline (GSK), jest to badanie niezależne, a badacze nie otrzymują żadnej rekompensaty finansowej.