Mitoquinas en la EPOC

INTRODUCCIÓN La Enfermedad Pulmonar Obstructiva Crónica (EPOC) se caracteriza por una obstrucción progresiva y difícilmente reversible de las vías respiratorias, que afecta fundamentalmente a las vías respiratorias pequeñas (bronquiolitis obstructiva crónica), asociada variablemente a destrucción del parénquima pulmonar (enfisema). El 10% de las personas mayores de 45 años tienen EPOC. Se espera que la EPOC sea la tercera causa principal de mortalidad en el mundo para 2020. La principal causa de EPOC en los países occidentales es el contacto crónico del humo del tabaco con las vías respiratorias, con entrada masiva de muchas sustancias tóxicas y especies reactivas de oxígeno (ROS) al cuerpo que inducen estrés oxidativo (OS). La OS en la EPOC es tanto exógena (ROS inhaladas) como endógena (ROS inducidas por los tóxicos del tabaco y por la propia enfermedad). Algunos investigadores consideran que el SG en la EPOC está estrechamente relacionado con un tipo peculiar de senescencia celular acelerada asociada a un proceso inflamatorio crónico que no solo afecta al sistema respiratorio, sino también a muchas otras partes del cuerpo (músculo esquelético, sistema cardiovascular, metabolismo global). , sistema inmunológico, etc.).

La disfunción mitocondrial juega un papel central, pero no exclusivo, en el estrés oxidativo, la senescencia celular y la inflamación crónica. Por tanto, un mejor conocimiento de la disfunción mitocondrial subyacente a la EPOC permitiría comprender mejor la fisiopatología e identificar nuevas posibles dianas terapéuticas. Las alteraciones mitocondriales de la EPOC a nivel broncopulmonar, muscular e inmunológico están ampliamente documentadas tanto morfológica como fisiopatológicamente. La disfunción mitocondrial puede ser primaria (congénita) o secundaria (adquirida, como en el caso del tabaquismo). Es un concepto amplio que incluye la producción de energía celular deteriorada, la generación excesiva de ROS o de algunos metabolitos del ciclo de Krebs en las mitocondrias y la pérdida del control de calidad de los componentes mitocondriales esenciales que finalmente conducen a una producción anormal de moléculas intramitocondriales (ADNmt, ATP, citocromo c, Romo1, etc.) al citosol y a los fluidos extracelulares. Algunas de estas moléculas se comportan como DAMP (patrones moleculares asociados al daño) e inducen una activación de la inmunidad innata y, por lo tanto, inflamación. Los niveles sanguíneos de Citocromo C y Romo1 se han propuesto como marcadores de estrés oxidativo. La función principal de las mitocondrias es la generación de ATP, la molécula básica portadora de energía para el mantenimiento de la célula viva. La generación de ATP se produce a partir de otros precursores energéticos en la mitocondria a través del sistema de fosforilación oxidativa acoplado a la cadena de transporte de electrones (OXPHOS/ETC). Estos orgánulos también juegan un papel fundamental en 1) la generación de metabolitos específicos de carbohidratos, lípidos y proteínas, que son esenciales para múltiples funciones celulares, 2) la síntesis de hemos y hormonas esteroides, 3) el manejo de los "clusters" de Fe y S, 4) la homeostasis celular del calcio intracelular, 5) la respuesta inmune, tanto innata como adquirida, y 6) la regulación de algunos tipos de apoptosis.

Las células reaccionan continuamente a los cambios ambientales a los que están expuestas. En situaciones de estrés celular (p. deprivación calórica, falta de nutrientes específicos, cambios de temperatura, etc.) el núcleo celular reacciona enviando señales a las mitocondrias para que modifiquen su función para adaptarse al cambio (señalización anterógrada del núcleo a las mitocondrias: por ejemplo el ejercicio físico consume ATP en la célula muscular, que activa la AMPK, que activa el cofactor de transcripción nuclear PGC-1alfa, que a su vez activa OXPOS/ETC y la biogénesis mitocondrial). Por otro lado, cuando hay una situación estresante en las propias mitocondrias (p. producción excesiva de radicales libres de oxígeno, proteínas intramitocondriales desplegadas, etc.) se envían señales al núcleo para que modifique la producción de proteínas destinadas a prevenir/corregir el daño mitocondrial, incluyendo chaperonas, antioxidantes o enzimas proteolíticas proteolíticas (señalización retrógrada autonómica o intracelular) .

Recientemente se ha demostrado que las mitocondrias son capaces de generar directa o indirectamente péptidos que no solo influyen en la propia célula que los produce, sino que tienen efectos a distancia (señalización retrógrada no autónoma o extracelular). Estas sustancias, descubiertas por el grupo de Dillin, se denominan mitoquinas y envían señales desde los tejidos con mitocondrias estresadas a todo el organismo, siendo hormonas que preparan a todo el organismo para responder al estrés celular al que se va a ver sometido.

Las mitoquinas se liberan cuando existe algún tipo de estrés mitocondrial (mutaciones congénitas o adquiridas en el mtDNA, trastornos del OXPHOS/ETC que generan estrés oxidativo, toxinas mitocondriales, etc.). En los mamíferos, el estrés mitocondrial generalmente se asocia con la llamada respuesta celular integrada al estrés (ICRS)". Uno de los mecanismos más importantes de la ICRS es la UPR (Unfolded protein response), en la que las mitocondrias participan de forma coordinada con el sistema del retículo endoplásmico y el núcleo celular.

Hay al menos dos tipos diferentes de mitoquinas: 1) mitoquinas primarias, codificadas en el ADN mitocondrial (ADNmt) y 2) mitoquinas secundarias, codificadas en el ADN del núcleo (ADNn), cuya secreción está regulada a través de señales de activación desde las mitocondrias estresadas hacia el ADNn (por ejemplo, ATF4, etc.). La humanina (HN), MOTS-c (ORF mitocondrial de los doce S-c) y seis péptidos similares a la humanina (SHLP 1-6) se consideran mitoquinas primarias, aunque el número puede ser mayor. Hasta hace poco tiempo, se pensaba que el ADN mitocondrial codificaba solo 37 genes (13 péptidos que se encuentran exclusivamente en la mitocondria, todos ellos subunidades de la ETC, 22 ARN de transferencia -ARNt- y 2 ARN ribosomal -ARNr-) ARN. Ahora sabemos que los rRNA 16s y 12s contienen sORF ("marcos de lectura abiertos cortos") que traducen péptidos secretores de 20-30 aa. Se desconoce qué mecanismos íntimos regulan la síntesis y liberación de estas mitoquinas, aunque es posible que estén relacionados con una activación ribosómica mitocondrial. En cuanto a las mitoquinas secundarias (las codificadas en el ADN nuclear) bajo la activación de ATF4 conocemos el factor de crecimiento fibroblástico 21 (FGF21), el factor de crecimiento y desarrollo 15 (MIC1/GDF15), la folistatina y la intermedina-adrenomedulina2. Estas mitoquinas también responden a otros estímulos, independientes de las mitocondrias.

La humanina es un péptido de 21 o 24 aa, con múltiples funciones citoprotectoras frente al daño mitocondrial (aumenta la síntesis de antioxidantes y chaperonas para 4 proteínas desplegadas). Es antiinflamatorio (disminuye las citocinas inflamatorias y aumenta las citocinas antiinflamatorias) y antiapoptótico (bloquea factores apoptóticos como Bak e IGFBP3), a través de al menos 2 receptores de membrana y varias interacciones con otras proteínas intracelulares y extracelulares, en muchos tejidos (sistema nervioso, hígado, corazón, pared vascular, músculo esquelético, epitelio pigmentario de la retina, gónadas, etc.). También tiene efectos metabólicos beneficiosos (disminuye la resistencia a la insulina a nivel central, protege a la célula beta pancreática del estrés oxidativo y tiene retroalimentación negativa con IGF1). Recientemente se ha comprobado que las personas con altos niveles de esta hormona tienen menos deterioro cognitivo con la edad y además son muy longevas.

MOTS-c es otro péptido pequeño de 16 aa, codificado por mtDNA, pero sintetizado exclusivamente en los ribosomas citosólicos, que también tiene efectos antioxidantes y metabólicos beneficiosos, ya que disminuye la resistencia a la insulina y previene la obesidad. Por otro lado, aumenta la resistencia frente a algunas infecciones y disminuye la reabsorción ósea, por lo que puede tener efectos antiosteoporóticos. Ambas hormonas son medibles en sangre por ELISA, aunque existen ciertas discrepancias en sus niveles plasmáticos según la prueba utilizada.

FGF21 es una hormona bien caracterizada que estimula la cetogénesis y la beta oxidación de los ácidos grasos. Su secreción está regulada por el ayuno y la activación de los receptores PPAR-α, pero también se sabe que aumenta en cualquier situación de estrés mitocondrial que activa las señales mitocondria-a-núcleo. El MIC1/GDF15 es otra hormona circulante que reduce el hambre, activando un nivel de receptor específico (GFRAL) que se encuentra en el área postrema y el núcleo del tracto solitario. Se han encontrado niveles elevados de GDF15 en la caquexia por cáncer y en muchas otras situaciones, entre ellas la EPOC. También se libera cuando se activan las señales mitocondrial-a-núcleo. En la EPOC, de todas las mitoquinas revisadas aquí, solo hay información sobre los niveles de GDF15 en sangre, pero no hay datos en la literatura sobre los niveles de las otras mitoquinas. A medida que avanza la EPOC, es probable que los niveles sanguíneos de mitoquinas aumenten progresivamente, expresando un mayor deterioro de la función mitocondrial, aunque sus niveles podrían aumentar solo hasta cierto nivel y luego disminuir cuando el daño mitocondrial es insoportable, constituyendo así una especie de respuesta mitohormética. HIPÓTESIS Las mitoquinas, expresadas en el contexto de la disfunción mitocondrial, están alteradas en pacientes con EPOC y se asocian con peores resultados clínicos. Además, las mitoquinas pueden utilizarse como factores pronósticos y posibles dianas terapéuticas en la EPOC. OBJETIVOS

1. - Describir los niveles de mitoquinas en un grupo control, un grupo de pacientes ambulatorios con EPOC estable y un grupo de pacientes con EPOC exacerbada.
2. - Describir diferencias en los niveles de semitonos en diferentes grupos de pacientes con EPOC (diferentes niveles de obstrucción, pacientes con alto riesgo de agudización vs sin riesgo de agudización, pacientes con puntuación CAT<10 vs resto de pacientes, pacientes con bajo Fat-Free- Índice de masa (FFMI) vs resto de pacientes).
3. -Evaluar la correlación entre semitonos y diferentes resultados clínicos como FFMI, distancia recorrida en el test de marcha de 6 minutos, FEV1, puntuación CAT.
4. - Evaluar si las mitoquinas se pueden utilizar para predecir el riesgo futuro de exacerbación e ingreso hospitalario.

MÉTODOS

Población de estudio

Los criterios de inclusión y exclusión:

Pacientes EPOC estables: serán seleccionados de las consultas externas de Neumología del Hospital

Universitario Marqués de Valdecilla. Los pacientes con EPOC deben cumplir los siguientes criterios:

40 años o más con volumen espiratorio forzado en 1 s [FEV1]/capacidad vital forzada [FVC] basal posbroncodilatador ≤0,70.

Pacientes con EPOC exacerbada: Serán seleccionados entre los pacientes ingresados ​​en el Hospital Universitario Marqués de Valdecilla con el diagnóstico de EPOC exacerbada.

Grupo control: se obtendrá de pacientes sin EPOC o cualquier otra afección respiratoria aguda o crónica y familiares de los pacientes.

Aceptando un riesgo alfa de 0,05 y un riesgo beta de 0,2 en la prueba de dos caras, se necesitan 30 sujetos en el primer grupo y 90 en el segundo para encontrar una diferencia de proporción estadísticamente significativa que se espera sea de 0,45 en el grupo 1 y 0,1 en el grupo 2 Previendo una tasa de abandono del 5%. La aproximación ARCSENUS. Este cálculo se ha realizado de acuerdo con estudios previamente publicados realizados por nuestro grupo. Calculamos un tamaño simple de 120 pacientes con EPOC, 30 pacientes con exacerbación de la EPOC y 30 controles.

Inscripción objetivo/tamaño de la muestra 180 Tasa anticipada de inscripción 25 pacientes cada mes Fecha estimada de inicio del estudio: Muestras recolectadas en Biobank a partir del 12.01.2019 Muestras enviadas al laboratorio de bioquímica 03.01.2020 Fecha estimada de finalización del estudio: (fin del seguimiento) 05.04.2021 Estudio Diseño y métodos Estudio observacional prospectivo. Los pacientes serán reclutados de clínicas ambulatorias de EPOC, clínicas ambulatorias para dejar de fumar y de pacientes hospitalizados debido a una exacerbación de la EPOC. Todos los pacientes recibirán un consentimiento informado por escrito para participar. Este estudio ya fue aprobado por el Comité Ético de Cantabria (CEIC).

Participantes

1. Se reclutará EPOC estable (40 años o más con volumen espiratorio forzado en 1 s [FEV1]/capacidad vital forzada [FVC] ≤0,70 después del broncodilatador basal) durante su seguimiento regular.
2. Grupo control: voluntarios apareados por edad y sexo sin diagnóstico previo de EPOC u otras afecciones respiratorias, y con volumen espiratorio forzado en 1 s [FEV1]/capacidad vital forzada [FVC] posbroncodilatador > 0,70.
3. Pacientes con EPOC exacerbada: Pacientes con diagnóstico previo de EPOC (40 años o más con volumen espiratorio forzado en 1 s [FEV1]/capacidad vital forzada [FVC] ≤0,70 basal posbroncodilatador) ingresados ​​en la planta de neumología del hospital por exacerbación de la EPOC.

Se registrará el índice de comorbilidad de Charlson de todos los participantes en el estudio. Pacientes con exacerbaciones agudas 1 mes antes del estudio, pacientes incluidos en rehabilitación pulmonar durante el estudio o 6 meses antes del periodo de inclusión, con otras posibles causas de sarcopenia (enfermedades malignas, insuficiencia cardiaca, hipertiroidismo u otras enfermedades crónicas devastadoras) y pacientes con las enfermedades renales crónicas conocidas o la lesión renal aguda reciente serán excluidas del estudio. Las muestras de sangre y todas las demás mediciones se realizarán el mismo día que los pacientes acepten participar en el estudio.

Características Clínicas

En el momento de la inscripción en el estudio, los pacientes con EPOC se dividirán en diferentes grupos categóricos: (1) pacientes no sintomáticos (puntuación de la prueba de evaluación de la EPOC [CAT] < 10) versus pacientes sintomáticos (puntuación CAT ≥10), (2) pacientes sin disnea (puntuación modificada de disnea del Medical Research Council [mMRC] < 2) versus pacientes con disnea (mMRC ≥2), pacientes con alto riesgo de exacerbaciones (aquellos con 2 o más exacerbaciones que requieren tratamiento con antibióticos o esteroides sistémicos o al menos un ingreso hospitalario en el último año) versus pacientes con bajo riesgo de exacerbación, y (4) ex fumadores versus fumadores activos. Tras entrar en el estudio, se obtendrán muestras de sangre y se realizará un seguimiento de los pacientes durante 1 año (una visita a los 6 meses y una visita a los 12 meses) y se registrarán prospectivamente las exacerbaciones y los ingresos hospitalarios. Durante el período de seguimiento, todos los investigadores clínicos del estudio no conocerán los resultados de las mitoquinas. Durante este periodo, se indicará a los pacientes con posibles agudizaciones pulmonares que acudan libremente al Servicio de Urgencias del Hospital y ese equipo médico decidirá libremente si hospitalizarlos o no, según su propio criterio clínico.

De acuerdo con los niveles de mitoquinas, los pacientes se dividirán en dos grupos: uno compuesto por aquellos dentro del cuartil más alto de mitoquinas y el otro grupo incluirá pacientes en los otros tres cuartiles de niveles de mitoquinas.

Las mediciones Basal Disnea se registrarán utilizando la escala de disnea mMRC. La puntuación CAT se registrará mediante un cuestionario autoadministrado. Las exacerbaciones previas se registrarán de las historias clínicas de los pacientes incluidos en el estudio. La espirometría se medirá de acuerdo con la American Thoracic Society/European Respiratory Society (ATS/ERS) en todos los sujetos.

La composición corporal se estimará mediante un dispositivo de impedancia bioeléctrica (OMROM BF511, Omrom, Japón), y el FFMI se calculará como la relación entre el FFM y la altura en metros cuadrados. La prueba de marcha de 6 min se realizará según el protocolo de la American Thoracic Society: se pide a los pacientes que caminen lo más que puedan en 6 min en un pasillo recto de 30 m sin interrupción. Al final de la prueba se registrará la distancia recorrida por los pacientes y la disnea. Se medirá humanina y MOTS-c por ELISA (Mybiosource), FGF21 y GDF15. Se medirá por ELISA (Quantikine). Si es posible, Romo1 se medirá también por ELISA. El estudio se dividirá en 3 visitas: VISITA 1: Toma de muestra de sangre y características clínicas. VISITA 2: 6 meses después de la visita 1: Exacerbaciones e ingresos hospitalarios (número y fecha) después de la visita 1. VISITA 3: 12 meses después de la visita 1: Exacerbaciones e ingresos hospitalarios (número y fecha) después de la visita 2.

Criterios de valoración del estudio Criterio de valoración principal: las mitoquinas se pueden utilizar para estimar el riesgo de ingreso hospitalario en pacientes con EPOC.

Puntos finales secundarios:

1. -Las mitoquinas se pueden utilizar para estimar el riesgo de exacerbación de la EPOC en pacientes con EPOC.
2. - Las mitoquinas están alteradas en pacientes con EPOC.
3. - Las mitoquinas están alteradas en las agudizaciones de la EPOC.
4. - Las mitoquinas se correlacionan con diferentes variables de la EPOC (FEV1, FFMI..).

Plan estadístico o análisis de datos Los datos se presentarán como media ± SD para datos normalmente distribuidos o mediana (rango intercuartílico) para datos no paramétricos. Las diferencias entre los grupos se analizarán mediante pruebas t no pareadas para datos paramétricos o pruebas de Mann-Whitney para datos no paramétricos.

Las correlaciones entre conjuntos de datos se examinaron utilizando el coeficiente de correlación de Pearson (r) para datos paramétricos o el coeficiente de correlación de rango de Spearman (rs) para datos no paramétricos. La distribución normal se probará mediante una prueba de Kolmogorov-Smirnov.

Las estimaciones de Kaplan-Meier se utilizarán para calcular la proporción de participantes que tienen un evento a lo largo del tiempo. Se realizará un análisis univariante y multivariante mediante el análisis de riesgo proporcional de Cox mediante el software SPSS versión 25.00 para PC para analizar la evolución de los primeros eventos según los niveles basales de mitoquinas, e identificar factores de riesgo asociados a exacerbaciones y hospitalización. Las diferencias se considerarán significativas si los valores de p fueron inferiores a 0,05. Todos los valores de p informados serán de dos caras.

Limitaciones y consideraciones éticas Este es un estudio unicéntrico por lo que debe ser replicado en estudios multicéntricos, utilizando un mayor número de pacientes provenientes de diferentes países. Aunque caras y complicadas, algunas técnicas como la biopsia muscular, la ergometría, la masa muscular cuantificada mediante TAC o el shuttle test podrían realizarse para tener una mejor visión general de la masa y función muscular en estos pacientes.

No se espera ningún daño potencial para los pacientes de este estudio. Este estudio fue aprobado por el comité de ética de Cantabria (Código: :2018.276). Aunque el estudio está financiado por la empresa GlaxoSmithKline (GSK), es un estudio independiente y los investigadores no reciben ninguna compensación económica.