Mitochiny u CHOPN

ÚVOD Chronická obstrukční plicní nemoc (CHOPN) je charakterizována progresivní a obtížně reverzibilní obstrukcí dýchacích cest, která v podstatě postihuje malé dýchací cesty (chronická obstrukční bronchiolitida), proměnlivě spojená s destrukcí plicního parenchymu (emfyzém). 10 % lidí ve věku nad 45 let má CHOPN. Očekává se, že CHOPN bude do roku 2020 třetí hlavní příčinou úmrtnosti na světě. Hlavní příčinou CHOPN v západních zemích je chronický kontakt tabákového kouře s dýchacími cestami s masivním vstupem mnoha toxických látek a reaktivních forem kyslíku (ROS) do těla, které vyvolávají oxidační stres (OS). OS u CHOPN je jak exogenní (inhalační ROS), tak endogenní (ROS indukovaný toxickými látkami z tabáku a vlastní chorobou). Někteří vědci se domnívají, že OS u CHOPN úzce souvisí se zvláštním typem zrychleného buněčného stárnutí spojeného s chronickým zánětlivým procesem, který postihuje nejen dýchací systém, ale také mnoho dalších částí těla (kosterní svalstvo, kardiovaskulární systém, globální metabolismus). imunologický systém atd.).

Mitochondriální dysfunkce hraje ústřední, nikoli však výhradní, roli v oxidativním stresu, buněčné senescenci a chronickém zánětu. Lepší porozumění mitochondriální dysfunkci, která je základem CHOPN, by proto umožnilo lépe porozumět fyziopatologii a identifikovat nové možné terapeutické cíle. Mitochondriální alterace CHOPN v bronchopulmonální, svalové a imunologické oblasti jsou široce dokumentovány jak morfologicky, tak patofyziologicky. Mitochondriální dysfunkce může být primární (vrozená) nebo sekundární (získaná, jako v případě kouření tabáku). Jde o široký koncept zahrnující zhoršenou produkci buněčné energie, nadměrnou tvorbu ROS nebo některých metabolitů z Krebsova cyklu v mitochondriích a ztrátu kontroly kvality esenciálních mitochondriálních komponent, které nakonec vedou k abnormálnímu výstupu intramitochondriálních molekul (mtDNA, ATP, cytochrom c, Romo1 atd.) do cytosolu a extracelulárních tekutin. Některé z těchto molekul se chovají jako DAMP (molekulární vzorce spojené s poškozením) a indukují aktivaci přirozené imunity, a tím zánět. Hladiny cytochromu C a Romo1 v krvi byly navrženy jako markery oxidačního stresu. Hlavní funkcí mitochondrií je tvorba ATP, základní molekuly přenášející energii pro udržení živé buňky. Tvorba ATP je produkována z jiných energetických prekurzorů v mitochondriích prostřednictvím systému oxidativní fosforylace spojeného s elektronovým transportním řetězcem (OXPHOS/ETC). Tyto organely také hrají zásadní roli při 1) tvorbě specifických metabolitů sacharidů, lipidů a proteinů, které jsou nezbytné pro mnohočetné buněčné funkce, 2) syntéze hemů a steroidních hormonů, 3) řízení „shluků“ Fe a S, 4) buněčná homeostáza intracelulárního vápníku, 5) imunitní odpověď, vrozená i získaná, a 6) regulace některých typů apoptózy.

Buňky nepřetržitě reagují na změny prostředí, kterým jsou vystaveny. V situacích buněčného stresu (např. kalorická deprivace, nedostatek specifických živin, změny teploty atd.) buněčné jádro reaguje vysíláním signálů do mitochondrií tak, že modifikují svou funkci, aby se změně přizpůsobily (anterográdní signalizace z jádra do mitochondrií: např. fyzické cvičení spotřebovává ATP ve svalové buňce, která aktivuje AMPK, která aktivuje jaderný transkripční kofaktor PGC-1alfa, který následně aktivuje OXPOS/ETC a mitochondriální biogenezi). Na druhou stranu, když dojde ke stresové situaci v samotných mitochondriích (např. nadměrná produkce volných kyslíkových radikálů, rozložené intramitochondriální proteiny atd.) jsou do jádra vysílány signály, aby modifikovalo produkci proteinů určených k prevenci/nápravě poškození mitochondrií, včetně chaperonů, antioxidantů nebo proteolytických enzymů proteolytických (autonomní nebo intracelulární retrográdní signalizace) .

Nedávno se ukázalo, že mitochondrie jsou schopny přímo nebo nepřímo generovat peptidy, které nejen ovlivňují vlastní buňku, která je produkuje, ale mají i na dálku účinky (neautonomní nebo extracelulární retrográdní signalizace). Tyto látky objevené Dillinovou skupinou se nazývají mitochiny a vysílají signály z tkání se stresovanými mitochondriemi do celého těla, jsou to hormony, které připravují celý organismus reagovat na buněčný stres, kterému bude vystaven.

Mitochiny se uvolňují při jakémkoli druhu mitochondriálního stresu (vrozené nebo získané mutace v mtDNA, poruchy OXPHOS/ETC, které generují oxidační stres, mitochondriální toxiny atd.). U savců je mitochondriální stres obecně spojen s takzvanou integrovanou buněčnou odpovědí na stres (ICRS)“. Jedním z nejdůležitějších mechanismů ICRS je UPR (Unfolded protein response), na kterém se mitochondrie podílejí koordinovaně se systémem endoplazmatického retikula a buněčným jádrem.

Existují alespoň dva různé typy mitoquinů: 1) primární mitoquiny, kódované v mitochondriální DNA (mtDNA) a 2) sekundární mytokiny, kódované v nucleus DNA (nDNA), jejichž sekrece je regulována aktivačními signály ze stresovaných mitochondrií do nDNA (např. ATF4 atd.). Humanin (HN), MOTS-c (mitochondriální ORF dvanácti S-c) a šest peptidů podobných humaninu (SHLP 1-6) jsou považovány za primární mitochiny, i když jejich počet může být vyšší. Donedávna se předpokládalo, že mitochondriální DNA kóduje pouze 37 genů (13 peptidů nacházejících se výhradně v mitochondriích, všechny jsou to podjednotky ETC, 22 transferových RNA -tRNA- a 2 ribozomální RNA -rRNA-) RNA. Nyní víme, že 16s a 12s rRNA obsahují sORF ("krátké otevřené čtecí rámce"), které překládají sekreční peptidy z 20-30 aa. Není známo, jaké intimní mechanismy regulují syntézu a uvolňování těchto mitoquinů, i když je možné, že souvisí s mitochondriální ribozomální aktivací. Co se týče sekundárních mitochinů (těch kódovaných v jaderné DNA) pod aktivací ATF4, známe fibroblastický růstový faktor 21 (FGF21), růstový a vývojový faktor 15 (MIC1/GDF15), follistatin a intermedin-adrenomedullin2. Tyto mitochiny také reagují na jiné podněty, nezávislé na mitochondriích.

Humanin je peptid s 21 nebo 24 aa, s mnoha cytoprotektivními funkcemi proti poškození mitochondrií (zvyšuje syntézu antioxidantů a chaperonů pro 4 nesbalené proteiny). Je protizánětlivý (snižuje zánětlivé cytokiny a zvyšuje protizánětlivé cytokiny) a antiapoptotický (blokuje apoptotické faktory, jako je Bak a IGFBP3), prostřednictvím alespoň 2 membránových receptorů a několika interakcí s jinými intracelulárními a extracelulárními proteiny v mnoha tkáních. (nervový systém, játra, srdce, cévní stěna, kosterní svalstvo, pigmentový epitel sítnice, gonády atd.). Má také příznivé metabolické účinky (snižuje inzulinovou rezistenci na centrální úrovni, chrání beta buňku pankreatu před oxidačním stresem a má negativní zpětnou vazbu s IGF1). Nedávno bylo prokázáno, že lidé s vysokou hladinou tohoto hormonu mají s věkem méně kognitivní poruchy a jsou také velmi dlouholetí.

MOTS-c je další malý peptid 16 aa, kódovaný mtDNA, ale syntetizovaný výhradně v cytosolických ribozomech, který má také příznivé antioxidační a metabolické účinky, protože snižuje inzulínovou rezistenci a zabraňuje obezitě. Na druhou stranu zvyšuje odolnost proti některým infekcím zvyšuje a snižuje kostní resorpci, takže může mít antiosteoporotické účinky. Oba hormony jsou měřitelné v krvi pomocí ELISA, i když existují určité nesrovnalosti v jejich plazmatických hladinách v závislosti na použitém testu.

FGF21 je dobře charakterizovaný hormon, který stimuluje ketogenezi a beta oxidaci mastných kyselin. Jeho sekrece je regulována hladověním a aktivací receptorů PPAR-α, ale je také známo, že stoupá v každé situaci mitochondriálního stresu, který aktivuje signály z mitochondrií do jádra. MIC1/GDF15 je další cirkulující hormon, který snižuje hlad, aktivuje hladinu specifického receptoru (GFRAL) nacházející se v oblasti postrema a v jádře solitárního traktu. Zvýšené hladiny GDF15 byly nalezeny u rakoviny kachexie a v mnoha dalších situacích, mezi nimi COPD. Uvolňuje se také, když jsou aktivovány signály z mitochondrií k jádru. U CHOPN jsou ze všech zde uvedených mitochinů pouze informace o hladinách GDF15 v krvi, ale v literatuře nejsou žádné údaje týkající se hladin ostatních mitochinů. Jak CHOPN postupuje, hladiny mitochinů v krvi se pravděpodobně progresivně zvyšují a vyjadřují další zhoršování funkce mitochondrií, i když jejich hladiny by se mohly zvyšovat pouze do určité úrovně a poté klesat, když je poškození mitochondrií nesnesitelné, což představuje určitý druh mitohormetické reakce. HYPOTÉZA Mitochiny, vyjádřené v souvislosti s mitochondriální dysfunkcí, jsou u pacientů s CHOPN změněny a jsou spojeny s nejhoršími klinickými výsledky. Kromě toho mohou být mitochiny použity jako prognostické faktory a potenciální terapeutické cíle u CHOPN. CÍLE

1. - Popsat hladiny mitochinů v kontrolní skupině, skupině stabilních ambulantních pacientů s CHOPN a skupině pacientů s exacerbací CHOPN.
2. - Popsat rozdíly v hladinách půltónů u různých skupin pacientů s CHOPN (různé úrovně obstrukce, pacienti s vysokým rizikem exacerbace vs. bez rizika exacerbace, pacienti s CAT skóre <10 oproti ostatním pacientům, pacienti s nízkým beztukovým- Hmotnostní index (FFMI) vs. zbytek pacientů).
3. -K vyhodnocení korelace mezi půltóny a různými klinickými výsledky, jako je FFMI, ušlá vzdálenost v 6minutovém testu chůze, FEV1, skóre CAT.
4. - Vyhodnotit, zda lze mitochiny použít k predikci budoucího rizika exacerbace a přijetí do nemocnice.

METODY

Studijní populace

Kritéria pro zařazení a vyloučení:

Stabilní pacienti s CHOPN: budou vybráni z pneumologických ambulancí nemocnice

Universitario Marqués de Valdecilla. Pacienti s CHOPN musí splňovat následující kritéria:

40 let nebo starší s výchozím postbronchodilatačním usilovným výdechovým objemem za 1 s [FEV1]/usilovaná vitální kapacita [FVC] ≤0,70.

Pacienti s exacerbací CHOPN: Budou vybráni z pacientů přijatých do nemocnice Universitario Marqués de Valdecilla s diagnózou exacerbace CHOPN.

Kontrolní skupina: bude získána od pacientů bez CHOPN nebo jakéhokoli jiného akutního nebo chronického respiračního onemocnění a příbuzných pacientů.

Přijetí alfa rizika 0,05 a beta rizika 0,2 ve oboustranném testu je nezbytných 30 subjektů v první skupině a 90 ve druhé, aby se zjistilo, že statisticky významný proporční rozdíl bude očekávaný 0,45 ve skupině 1 a 0,1 ve skupině 2 Očekává se 5% míra opuštění. Aproximace ARCSINUS. Tento výpočet byl proveden podle dříve publikovaných studií provedených naší skupinou. Vypočítáme jednoduchou velikost 120 pacientů s CHOPN, 30 pacientů s exacerbací CHOPN a 30 kontrol.

Cílový zápis/velikost vzorku 180 Předpokládaná míra zápisu 25 pacientů každý měsíc Předpokládané datum zahájení studie: Vzorky odebrané v Biobance od 1.12.2019 Vzorky odeslány do biochemické laboratoře 01.03.2020 Předpokládané datum ukončení studia: (konec sledování) 05.04.2021 Design a metody studie Observační prospektivní studie. Pacienti se budou rekrutovat z ambulancí CHOPN, ambulancí pro odvykání kouření a z pacientů hospitalizovaných kvůli exacerbaci CHOPN. Všichni pacienti obdrží písemný informovaný souhlas s účastí. Tato studie již byla schválena Etickou komisí Kantábrie (CEIC).

Účastníci

1. Stabilní CHOPN (40 let nebo starší s výchozím objemem po bronchodilatačním usilovném výdechu za 1 s [FEV1]/usilovaná vitální kapacita [FVC] ≤0,70) bude nábor během jejich pravidelného sledování.
2. Kontrolní skupina: dobrovolníci stejného věku a pohlaví bez předchozí diagnózy CHOPN nebo jiných respiračních stavů as post-bronchodilatančním usilovným výdechovým objemem za 1 s [FEV1]/usilovaná vitální kapacita [FVC] >0,70.
3. Pacienti s exacerbací CHOPN: Pacienti s předchozí diagnózou CHOPN (40 let nebo starší s výchozím objemem usilovného výdechu po bronchodilataci za 1 s [FEV1]/usilovaná vitální kapacita [FVC] ≤ 0,70) přijati na pulmonologické oddělení nemocnice kvůli exacerbaci CHOPN.

Charlsonův index komorbidity bude zaznamenán od všech účastníků studie. Pacienti s akutními exacerbacemi 1 měsíc před studií, pacienti zařazení do plicní rehabilitace během studie nebo 6 měsíců před obdobím zařazení, s jinými potenciálními příčinami sarkopenie (maligní onemocnění, srdeční selhání, hypertyreóza nebo jiná chronická devastující onemocnění) a pacienti s známá chronická onemocnění ledvin nebo nedávné akutní poškození ledvin budou ze studie vyloučeny. Vzorky krve a všechna další měření budou provedena ve stejný den, kdy pacienti souhlasí se vstupem do studie.

Klinické charakteristiky

Při zařazení do studie budou pacienti s CHOPN rozděleni do různých kategoriálních skupin: (1) nesymptomatickí pacienti (COPD Assessment Test [CAT] skóre < 10) versus symptomatickí pacienti (CAT skóre ≥10), (2) nedušní pacienti (upravené skóre dušnosti Medical Research Council [mMRC] < 2) oproti pacientům s dušností (mMRC ≥2), vysoké riziko exacerbací pacientů (u pacientů se 2 nebo více exacerbacemi vyžadujícími léčbu antibiotiky nebo systémovými steroidy nebo alespoň jednou hospitalizací v předchozím případě rok) versus nízké riziko pacientů s exacerbací a (4) bývalí kuřáci versus aktivní kuřáci. Po vstupu do studie budou odebrány vzorky krve a pacienti budou sledováni po dobu 1 roku (jedna návštěva po 6 měsících a jedna návštěva po 12 měsících) a prospektivně budou zaznamenávány exacerbace a hospitalizace. Během období sledování budou všichni kliničtí výzkumníci ve studii zaslepeni vůči výsledkům mitoquinů. Po tuto dobu budou pacienti s možnými plicními exacerbacemi instruováni, aby šli volně na oddělení urgentního příjmu nemocnice a tým lékařů se podle vlastních klinických kritérií svobodně rozhodl, zda je hospitalizovat či nikoli.

Podle hladin mitoquinů budou pacienti rozděleni do dvou skupin: jedna složená z pacientů v nejvyšším kvartilu mitoquinů a druhá skupina bude zahrnovat pacienty v ostatních třech kvartilech hladin mitoquinů.

Měření Bazální dušnost bude zaznamenávána pomocí stupnice dušnosti mMRC. CAT skóre bude zaznamenáváno pomocí dotazníku, který si sami zadají. Předchozí exacerbace budou zaznamenány z klinických záznamů od pacientů zařazených do studie. Spirometrie bude měřena podle American Thoracic Society/European Respiratory Society (ATS/ERS) u všech subjektů.

Složení těla bude odhadnuto pomocí bioelektrického impedančního zařízení (OMROM BF511, Omrom, Japonsko) a FFMI bude vypočteno jako poměr FFM k výšce v metrech na druhou. 6minutový test chůze bude proveden podle protokolu Americké hrudní společnosti: pacienti byli požádáni, aby došli tak daleko, jak dokážou za 6 minut v 30m rovné chodbě bez jakéhokoli přerušení. Na konci testu bude zaznamenána vzdálenost, kterou pacient ušel, a dušnost. Humanin a MOTS-c budou měřeny pomocí ELISA (Mybiosource), FGF21 y GDF15. Bude měřeno ELISA (Quantikine). Pokud je to možné, Romo1 bude měřen také pomocí ELISA. Studie bude rozdělena do 3 návštěv: NÁVŠTĚVA 1: Odběr vzorků krve a klinické charakteristiky. NÁVŠTĚVA 2: 6 měsíců po návštěvě 1: Exacerbace a přijetí do nemocnice (počet a datum) po návštěvě 1. NÁVŠTĚVA 3: 12 měsíců po návštěvě 1: Exacerbace a přijetí do nemocnice (počet a datum) po návštěvě 2.

Cílové body studie Primární cílový bod: Mitochiny lze použít k odhadu rizika přijetí do nemocnice u pacientů s CHOPN.

Sekundární koncové body:

1. -Mitochiny lze použít k odhadu rizika exacerbace CHOPN u pacientů s CHOPN.
2. - Mitochiny jsou u pacientů s CHOPN alterovány.
3. - Mitochiny jsou při exacerbacích CHOPN změněny.
4. - Mitochiny korelují s různými proměnnými CHOPN (FEV1, FFMI...).

Statistický plán nebo analýza dat Data budou prezentována jako průměr ± SD pro normálně rozložená data nebo medián (interkvartilní rozmezí) pro neparametrická data. Rozdíly mezi skupinami budou analyzovány pomocí nepárových t testů pro parametrická data nebo Mann-Whitneyho testů pro neparametrická data.

Korelace mezi datovými soubory byly zkoumány pomocí Pearsonova (r) korelačního koeficientu pro parametrická data nebo Spearmanova rank (rs) korelačního koeficientu pro neparametrická data. Normální rozdělení bude testováno pomocí Kolmogorova-Smirnovova testu.

Kaplan-Meierovy odhady budou použity k výpočtu podílu účastníků, kteří mají událost v průběhu času. Jednorozměrná a vícerozměrná analýza pomocí Coxovy proporcionální analýzy rizik bude provedena pomocí softwaru SPSS verze 25.00 pro PC k analýze vývoje prvních příhod podle bazálních hladin mitoquinů a k identifikaci rizikových faktorů spojených s exacerbacemi a hospitalizací. Rozdíly budou považovány za významné, pokud byly hodnoty p menší než 0,05. Všechny uvedené hodnoty p budou oboustranné.

Omezení a etické úvahy Toto je studie s jedním centrem, a proto musí být replikována v multicentrických studiích s použitím vyššího počtu pacientů pocházejících z různých zemí. I když jsou drahé a komplikované, některé techniky, jako je svalová biopsie, ergometrie, svalová hmota kvantifikovaná pomocí CT nebo kyvadlového testu, by mohly být provedeny, aby bylo možné získat lepší přehled o svalové hmotě a funkci u těchto pacientů.

Od této studie se neočekává žádné potenciální poškození pacientů. Tato studie byla schválena etickou komisí Cantabria (Kód: 2018.276). Přestože je studie financována společností GlaxoSmithKline (GSK), jedná se o nezávislou studii a vyšetřovatelé nedostávají žádnou finanční odměnu.