COPDにおけるミトキン

はじめに 慢性閉塞性肺疾患 (COPD) は、気道の進行性でほとんど可逆的な閉塞を特徴とし、基本的に細い気道に影響を与え (慢性閉塞性細気管支炎)、肺実質の破壊 (肺気腫) とさまざまに関連しています。 45 歳以上の 10% の人が COPD を患っています。 COPD は、2020 年までに世界の死亡原因の第 3 位になると予想されています。 西側諸国における COPD の主な原因は、タバコの煙が気道に慢性的に接触することであり、酸化ストレス (OS) を誘発する多くの有毒物質と活性酸素種 (ROS) が体内に大量に侵入します。 COPD の OS は、外因性 (吸入された ROS) と内因性 (タバコの毒物および自身の疾患によって誘発される ROS) の両方です。 一部の研究者は、COPD の OS は、呼吸器系だけでなく、身体の他の多くの部分 (骨格筋、心血管系、全体的な代謝、免疫系など）。

ミトコンドリアの機能不全は、酸化ストレス、細胞老化、および慢性炎症において中心的な役割を果たしますが、排他的ではありません。 したがって、COPD の根底にあるミトコンドリア機能障害をよりよく理解することで、生理病理学をよりよく理解し、新しい可能な治療標的を特定することが可能になります。 気管支肺、筋肉、および免疫学的領域における COPD のミトコンドリアの変化は、形態学的にも病態生理学的にも広く報告されています。ミトコンドリア機能不全は、一次性（先天性）または二次性（喫煙の場合のように後天性）である可能性があります。 これは、細胞エネルギー産生の障害、ROS の過剰な生成、またはミトコンドリアのクレブス サイクルからの一部の代謝産物の過剰な生成、ミトコンドリア内分子 (mtDNA、ATP、シトクロム c、Romo1 など) をサイトゾルおよび細胞外液に供給します。 これらの分子の一部は、DAMP (損傷関連分子パターン) のように振る舞い、自然免疫の活性化を誘発し、炎症を引き起こします。 シトクロム C と Romo1 の血中濃度は、酸化ストレスのマーカーとして提案されています。 ミトコンドリアの主な機能は、生細胞を維持するための基本的なエネルギー運搬分子である ATP の生成です。 ATP の生成は、電子伝達系 (OXPHOS/ETC) に結合した酸化的リン酸化システムを介して、ミトコンドリア内の他のエネルギー前駆体から生成されます。 これらのオルガネラは、1) 複数の細胞機能に不可欠な炭水化物、脂質、およびタンパク質の特定の代謝産物の生成、2) ヘムおよびステロイド ホルモンの合成、3) の「クラスター」の管理においても基本的な役割を果たします。 Fe と S、4) 細胞内カルシウムの細胞恒常性、5) 自然免疫と後天性の両方の免疫応答、および 6) ある種のアポトーシスの調節。

細胞は、さらされている環境の変化に継続的に反応します。 細胞ストレスの状況（例： カロリー欠乏、特定の栄養素の欠乏、気温の変化など) 細胞核はミトコンドリアにシグナルを送ることで反応し、変化に適応するように機能を変更します (核からミトコンドリアへの順行性シグナル伝達: たとえば、身体運動は消費しますAMPK を活性化する筋細胞内の ATP は、核転写補助因子 PGC-1alpha を活性化し、次に OXPOS/ETC およびミトコンドリア生合成を活性化します。 一方、ミトコンドリア自体にストレスの多い状況がある場合 (例: 過剰な酸素フリーラジカルの生成、ミトコンドリア内タンパク質のアンフォールディングなど) シグナルが核に送られ、シャペロン、抗酸化物質、またはタンパク質分解酵素を含む、ミトコンドリアの損傷を防止/修正することを目的としたタンパク質の生成を変更します (自律神経または細胞内の逆行性シグナル伝達) .

ミトコンドリアは最近、直接的または間接的にペプチドを生成できることが示されました。ペプチドは、ペプチドを生成する細胞自身に影響を与えるだけでなく、遠隔効果 (非自律的または細胞外の逆行性シグナル伝達) を持っています。 ディリンのグループによって発見されたこれらの物質はミトキンと呼ばれ、ストレスを受けたミトコンドリアを含む組織から全身に信号を送ります。これは、生物全体が受ける細胞ストレスに応答するように準備するホルモンです。

ミトキンは、何らかのミトコンドリア ストレス (mtDNA の先天的または後天的変異、酸化ストレスを生成する OXPHOS/ETC の障害、ミトコンドリア毒素など) がある場合に放出されます。 哺乳動物では、ミトコンドリアのストレスは一般に、いわゆるストレスに対する統合細胞応答 (ICRS) と関連しています。 ICRS の最も重要なメカニズムの 1 つは UPR (Unfolded protein response) であり、ミトコンドリアは小胞体系および細胞核と協調して関与します。

ミトキンには、少なくとも 2 つの異なるタイプがあります。1) ミトコンドリア DNA (mtDNA) にコードされる一次マイトキンと、2) 核 DNA (nDNA) にコードされる二次マイトカインで、ストレスを受けたミトコンドリアから細胞への活性化シグナルによって分泌が調節されます。 nDNA (例: ATF4など）。 ヒューマニン (HN)、MOTS-c (12 S-c のミトコンドリア ORF)、およびヒューマニンに類似した 6 つのペプチド (SHLP 1 ～ 6) は、数が多い可能性がありますが、主要なミトキンと見なされます。 最近まで、ミトコンドリア DNA は 37 個の遺伝子 (ミトコンドリアのみに存在する 13 個のペプチド、そのすべてが ETC のサブユニット、22 個のトランスファー RNA (tRNA)、および 2 個のリボソーム RNA (rRNA)) のみをコードしていると考えられていました。 現在、16s および 12s rRNA には 20 ～ 30 aa の分泌ペプチドを翻訳する sORF (「短いオープン リーディング フレーム」) が含まれていることがわかっています。 ミトコンドリアのリボソーム活性化に関連している可能性はありますが、これらのミトキンの合成と放出を調節する密接なメカニズムは不明です。 ATF4 の活性化下での二次ミトキン (核 DNA にコードされるもの) に関しては、線維芽細胞増殖因子 21 (FGF21)、増殖および発生因子 15 (MIC1/GDF15)、フォリスタチン、およびインターメジン-アドレノメデュリン 2 が知られています。 これらのミトキンは、ミトコンドリアとは関係なく、他の刺激にも反応します。

ヒューマニンは 21 または 24 aa のペプチドであり、ミトコンドリアの損傷に対する複数の細胞保護機能を備えています (4 つのアンフォールド タンパク質の抗酸化物質およびシャペロンの合成を増加させます)。 多くの組織で、少なくとも2つの膜受容体と他の細胞内および細胞外タンパク質とのいくつかの相互作用を介して、抗炎症性（炎症性サイトカインを低下させ、抗炎症性サイトカインを上昇させる）および抗アポトーシス（BakやIGFBP3などのアポトーシス因子をブロックする）です。 (神経系、肝臓、心臓、血管壁、骨格筋、網膜色素上皮、生殖腺など)。 また、有益な代謝効果もあります (中枢レベルでインスリン抵抗性を低下させ、膵臓のベータ細胞を酸化ストレスから保護し、IGF1 で負のフィードバックを与えます)。 最近、このホルモンのレベルが高い人は、加齢に伴う認知障害が少なく、非常に長寿であることが証明されています.

MOTS-c は 16 aa のもう 1 つの小さなペプチドで、mtDNA をコードしていますが、サイトゾルのリボソームでのみ合成され、インスリン抵抗性を低下させ、肥満を防ぐため、有益な抗酸化作用と代謝効果もあります。 一方で、一部の感染症に対する抵抗力を高め、骨吸収を減少させるため、抗骨粗鬆症効果がある可能性があります。 どちらのホルモンも ELISA によって血液中で測定できますが、使用する検査によっては血漿レベルに一定の差異があります。

FGF21 は、脂肪酸のケトン生成とベータ酸化を刺激する、よく特徴付けられたホルモンです。 その分泌は、絶食と受容体 PPAR-α の活性化によって調節されますが、ミトコンドリアから核へのシグナルを活性化するミトコンドリアストレスのあらゆる状況で上昇することも知られています。 MIC1/GDF15 は、飢餓を軽減し、後腎領域と孤立路の核に見られる特定の受容体レベル (GFRAL) を活性化するもう 1 つの循環ホルモンです。 GDF15 レベルの上昇は、がん悪液質や、COPD を含む他の多くの状況で発見されています。 また、ミトコンドリアから核へのシグナルが活性化されたときにも放出されます。 COPD では、ここで検討したすべてのミトキンのうち、GDF15 血中レベルに関する情報しかありませんが、他のミトキンのレベルに関するデータは文献にありません。 COPD が進行するにつれて、ミトキンの血中濃度は徐々に上昇し、ミトコンドリア機能のさらなる低下を表す可能性がありますが、その濃度は特定のレベルまでしか上昇せず、ミトコンドリアの損傷が耐えられなくなると低下し、一種のミトホルメティック反応を構成します。 仮説 ミトコンドリア機能不全の文脈で表現されるミトキンは、COPD患者で変化し、最悪の臨床転帰と関連しています。 さらに、マイトキンは COPD の予後因子および潜在的な治療標的として使用できます。 目的

1. -対照群、安定したCOPD外来患者のグループ、および悪化したCOPD患者のグループにおけるミトキンレベルを説明する。
2. - COPD 患者のさまざまなグループにおける半音レベルの違いを説明する (さまざまなレベルの閉塞、増悪のリスクが高い患者と増悪のリスクがない患者、CAT スコアが 10 未満の患者と残りの患者、Fat-Free が低い患者-質量指数（FFMI）対残りの患者）。
3. -セミトーンと FFMI、6 分間歩行テストでの歩行距離、FEV1、CAT スコアなどのさまざまな臨床結果との相関関係を評価する。
4. -マイトキンが増悪と入院の将来のリスクを予測するために使用できるかどうかを評価する。

方法

調査対象母集団

包含および除外基準:

安定した COPD 患者: 病院の呼吸器科の外来診療所から選択されます。

マルケス・デ・バルデシージャ大学。 COPD 患者は、次の基準を満たさなければなりません。

40 歳以上で、ベースラインの気管支拡張薬投与後の強制呼気量が 1 秒 [FEV1]/強制肺活量 [FVC] ≤0.70 である。

増悪した COPD 患者: COPD 増悪と診断され、病院 Universitario Marqués de Valdecilla に入院した患者から選択されます。

対照群：COPDまたはその他の急性または慢性呼吸器疾患のない患者および患者の近親者から取得されます。

両側検定で 0.05 のアルファ リスクと 0.2 のベータ リスクを受け入れると、最初のグループで 30 人の被験者、2 番目のグループで 90 人の被験者が必要であり、統計的に有意な割合の差がグループ 1 で 0.45、グループ 2 で 0.1 であると予想されます。 . ドロップアウト率 5% を見込んでいます。 ARCSINUS 近似。 この計算は、私たちのグループによって実行された以前に公開された研究に従って実行されました。 COPD 患者 120 人、COPD 増悪患者 30 人、対照 30 人の単純なサイズを計算します。

目標登録数/サンプルサイズ 180 予想登録率 毎月 25 人の患者 研究開始予定日: 2019 年 12 月 1 日から Biobank で収集されたサンプル サンプルは生化学研究室に送信されました 01.03.2020 研究完了予定日: (フォローアップ終了) 05.04.2021 研究デザインと方法 観察的前向き研究。 患者は、COPD 外来診療所、禁煙外来診療所、および COPD 増悪のために入院している患者から募集されます。 すべての患者には、参加するための書面によるインフォームドコンセントが与えられます。 この研究は、カンタブリアの倫理委員会 (CEIC) によって既に承認されています。

参加者

1. 安定した COPD (40 歳以上で、ベースラインの気管支拡張薬強制呼気量が 1 秒 [FEV1]/強制肺活量 [FVC] ≤0.70) は、定期的なフォローアップ中に募集されます。
2. 対照群: 年齢および性別が一致し、COPD またはその他の呼吸器疾患の診断歴がなく、気管支拡張薬を使用した後 1 秒の強制呼気量 [FEV1]/強制肺活量 [FVC] >0.70 のボランティア。
3. 増悪した COPD 患者: 以前に COPD と診断された患者 (40 歳以上でベースラインの気管支拡張薬投与後の強制呼気量が 1 秒 [FEV1]/強制肺活量 [FVC] ≤0.70) で、COPD 増悪のために病院の呼吸器病棟に入院した患者。

チャールソン併存疾患指数は、研究のすべての参加者から記録されます。 研究の1か月前に急性増悪を起こした患者、研究中または包含期間の6か月前に肺リハビリテーションに参加した患者、サルコペニアの他の潜在的な原因（悪性疾患、心不全、甲状腺機能亢進症またはその他の慢性壊滅的疾患）および既知の慢性腎疾患または最近の急性腎障害は研究から除外されます。 血液サンプルおよび他のすべての測定は、患者が研究への参加を受け入れた同じ日に行われます。

臨床的特徴

研究への登録時に、COPD 患者は異なるカテゴリ グループに分けられます。 (変更された医学研究評議会の呼吸困難スコア [mMRC] < 2) 対 呼吸困難患者 (mMRC ≥2)、増悪のリスクが高い患者 (抗生物質または全身性ステロイドによる治療、または過去に少なくとも 1 回の入院が必要な 2 回以上の増悪を伴う患者)年）対増悪患者の低リスク、および（4）元喫煙者対現喫煙者。 研究に入った後、血液サンプルを採取し、患者を1年間追跡調査し（6か月後に1回、12か月後に1回）、増悪と入院を前向きに記録します。 フォローアップ期間中、研究のすべての臨床研究者は、マイトキンの結果を知らされません。 この期間中、肺の増悪の可能性がある患者は、病院の救急部門に自由に行くように指示され、医師のチームは、独自の臨床基準に従って、入院するかどうかを自由に決定します。

ミトキンのレベルに応じて、患者は 2 つのグループに分けられます。1 つはミトキンの最高四分位内の患者で構成され、もう 1 つのグループにはミトキンのレベルの他の 3 つの四分位の患者が含まれます。

測定 基礎呼吸困難は、mMRC呼吸困難スケールを使用して記録されます。 CAT スコアは、自己管理アンケートによって記録されます。 以前の増悪は、研究に含まれる患者の臨床記録から記録されます。 スパイロメトリーは、すべての被験者で米国胸部学会/欧州呼吸器学会 (ATS/ERS) に従って測定されます。

体組成は、生体電気インピーダンス装置 (OMROM BF511、オムロム、日本) によって推定され、FFMI は、FFM と身長の 2 乗の比として計算されます。 6 分間の歩行テストは、米国胸部学会のプロトコルに従って実施されます。患者は、中断することなく 30 m の直線廊下を 6 分間でできるだけ遠くまで歩くように求められました。 テストの最後に、患者が歩いた距離と呼吸困難が記録されます。 ヒューマニンおよびMOTS-cはELISA（Mybiosource）、FGF21およびGDF15によって測定されます。 ELISA（Quantikine）で測定します。 可能であれば、Romo1 は ELISA によっても測定されます。 調査は 3 回の訪問に分けられます: 訪問 1: 血液サンプルの収集と臨床的特徴。 VISIT 2: Visit 1 の 6 か月後: Visit 1 後の増悪と入院 (数と日付)。 VISIT 3: Visit 1 の 12 か月後: Visit 2 後の増悪と入院 (数と日付)。

試験のエンドポイント 主要エンドポイント：マイトキンは、COPD 患者の入院リスクを推定するために使用できます。

二次エンドポイント:

1. -マイトキンは、COPD 患者の COPD 増悪リスクを推定するために使用できます。
2. - COPD患者ではミトキンが変化しています。
3. - ミトキンは COPD 増悪で変化します。
4. - Mitoquines は、さまざまな COPD 変数 (FEV1、FFMI..) と相関します。

統計計画またはデータ分析 データは、正規分布データの場合は平均 ± SD、ノンパラメトリック データの場合は中央値 (四分位範囲) として表示されます。 グループ間の違いは、パラメトリック データの対応のない t 検定またはノンパラメトリック データのマン-ホイットニー検定を使用して分析されます。

データ セット間の相関関係は、パラメトリック データのピアソン (r) 相関係数またはノンパラメトリック データのスピアマン ランク (rs) 相関係数を使用して調べられました。 正規分布は、コルモゴロフ-スミルノフ検定を使用して検定されます。

Kaplan-Meier 推定を使用して、時間の経過とともにイベントが発生した参加者の割合を計算します。 Cox比例リスク分析を使用した単変量および多変量分析は、PC用のSPSSソフトウェアバージョン25.00を使用して実行され、ミトキンの基礎レベルに従って最初のイベントの発生を分析し、増悪および入院に関連する危険因子を特定します。 p 値が 0.05 未満の場合、差は有意と見なされます。 報告されるすべての p 値は両側になります。

制限と倫理的考慮事項 これは単一施設の研究であるため、さまざまな国から来たより多くの患者を使用して、多施設の研究で再現する必要があります。 高価で複雑ではありますが、筋肉生検、エルゴメトリー、CT またはシャトル テストを使用して定量化された筋肉量などのいくつかの手法を実行して、これらの患者の筋肉量と機能をよりよく概観することができます。

この研究による患者への潜在的な害はないと予想されます。 この研究は、カンタブリア倫理委員会によって承認されました (コード::2018.276)。 この研究はグラクソ・スミスクライン社（GSK）によって資金提供されていますが、独立した研究であり、研究者は金銭的補償を受けていません.