糖尿病和 microRNA 作为轻度认知障碍的危险因素：生活方式改变的影响

目前的研究是在2016年2月至2019年6月期间分两步进行的。

1. 第一步（基线评估）：这是对在 NRC 门诊就诊的 163 名 2 型糖尿病 (T2DM) 患者进行的横断面研究。患者为男性 65 名，女性 98 名；年龄在 40 至 65 岁之间。 所有患者均识字并能够完成认知功能测试。 排除标准是有头部外伤、中风、短暂性脑缺血发作、脑肿瘤、癫痫、精神疾病、心脏或肝功能衰竭以及视力或听力障碍病史的 T2DM 患者。 获得了 NRC 伦理委员会的批准，注册号为 15131。 参与者在被纳入研究之前签署了书面知情同意书。

1.1 对所有参与者进行面对面访谈，收集有关人口统计学、病史和认知功能的数据。 数据包括年龄、性别、教育水平和吸烟情况。 详细的糖尿病病史取自患者，包括糖尿病诊断年龄、低血糖发作频率、治疗类型（胰岛素或口服降糖药）、高血压病史、血脂异常或其他疾病和服用的药物。 记录任何提示存在感觉性周围神经病变的主诉，例如手脚刺痛、灼痛或麻木。 所有研究参与者都接受了全面的临床检查、收缩压和舒张压以及人体测量评估（体重和身高测量）。

1.2 认知功能及其领域的评估使用 Adenbrooke 的认知考试 III (ACE III) 测试进行，该测试评估五个认知领域：注意力、记忆力、语言流畅性、语言和视觉空间能力。 它是最可靠和经过验证的阿拉伯语形式认知量表，可免费使用。 如果 ACE III 评分小于 88，则考虑客观轻度认知障碍（MCI）。 还使用了 Trail Making Test (TMT)。 TMT 是神经心理学评估中使用最广泛的工具之一，作为认知处理和执行功能速度的指标。 它通过测量连接一系列按顺序编号和字母的圆圈所需的时间来评估注意力、注意力、心理运动速度、认知转变和复杂的排序功能。 测试由两部分组成（A 和 B）。 每个部分的直接分数以完成任务的时间来表示。 时间越短表明认知功能越好。

1.3 采用汉密尔顿抑郁量表（HRSD），它是目前应用最广泛的客观评价抑郁严重程度的量表之一。 该量表包括 17 个项目，每个项目均以 3 或 5 分制计分，最终得分表明患者抑郁的严重程度。 根据英国国家健康与临床卓越研究所（UK）对抑郁程度进行分级（0-7=正常，8-13=轻度抑郁，14-18=中度抑郁，19-22=重度抑郁症和 ≥ 23 = 非常严重的抑郁症）。

1.4 健康相关生活质量（HRQOL）的评估采用简表36（SF-36）问卷进行。 该问卷包含 36 个项目，包括身体功能（PF）、身体角色（RP）、身体疼痛（BP）、一般健康感知 GH）、活力（VT）、社会功能（SF）、角色情绪八个健康状况领域(RE) 和心理健康 (MH)。 每个领域的评分从 0 到 100，“100”是健康的最佳评分。 使用了阿拉伯语版本的问卷。

1.5 T2DM患者生活方式的评估。 向患者提供了一份设计好的问卷，以评估他们在营养习惯、身体、社交和心理活动方面的生活方式，以及对激励他们改变生活方式的最佳方式的看法。

1.6 基线实验室分析。 在研究开始时禁食至少 10 小时后，在完全无菌技术下从每位参与者身上抽取 5 毫升血样。 它分为干燥普通管和淡紫色乙二胺四乙酸 (EDTA) 真空采血管。 使用 Olympus-au-400 化学自动分析仪评估糖化血红蛋白 (HbA1c) 和血液总胆固醇水平。 使用基于竞争性结合酶免疫测定技术的 ELISA 试剂盒测定血清中的丙二醛 (MDA) 浓度。 检查红细胞的过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶 (GPx) 和谷胱甘肽还原酶 (GR) 的酶促抗氧化活性。

1.7 miRNAs表达分析：将血液抽入特制的RNA保存管中；倒置8-10次，然后-80℃冷冻保存，用于进一步提取RNA。 在开始表征 miRNA 表达之前，采用了 RNA 分离和 RNA 质量评估。 只有 1-10 纳克的纯化总 RNA 或等同物足以可靠地量化感兴趣的 miRNA。 根据制造商的说明，本研究中选择的 miRNA 的浓度是通过血浆样品中的单靶标 TaqMan miRNA 定量实时 (qRT) 聚合酶链反应 (PCR) 测定法 (Applied Biosystems) 确定的。 应用两步方案，仅需要使用 miRNA 特异性引物进行逆转录，然后使用 TaqMan 探针进行实时 PCR。 TaqMan MicroRNA Assays 是一种靶标特异性茎环结构逆转录引物。 茎环实现两个目标：1) 仅针对成熟 miRNA 靶标的特异性，以及 2) 形成逆转录酶 (RT) 引物/成熟 miRNA 嵌合体，延伸 miRNA 的 5' 端。 包含 RNA 样本、环状引物、1 X 缓冲液、逆转录酶和 RNase 抑制剂的 RT 反应将分别在 16°C 和 42°C 下孵育 30 分钟。 由此产生的更长的 RT 扩增子提供了一个模板，适用于使用 TaqMan 检测的标准实时 PCR。 然后在 Quant Studio 12 K Flex 实时 PCR 仪上进行实时 PCR。

第二步（介入试验）：这一步是针对健康教育和生活方式改变的介入研究。 开展了对 T2DM 患者实施生活方式改变计划。

2.1 设计两本健康教育手册 在确定 T2DM 参与者的需求后，研究团队设计了两本健康教育手册。 第一本小册子名为“糖尿病及其并发症的控制方法”。 这本小册子包括有关 T2DM 疾病的信息，以及它如何影响导致糖尿病 (DM) 并发症的不同身体系统。 它还包括有关空腹血糖和糖化血红蛋白 (HbA1c) 正常和异常水平的信息。 它展示了如何控制和预防糖尿病并发症，强调健康的营养和碳水化合物计数、身体活动、严格遵守医疗方案和避免压力。 第二本小册子名为《轻度认知障碍及其预防方法》，内容包括认知功能的定义、MCI和阿尔茨海默病及其与T2DM的关系、认知障碍的危险因素以及如何控制和改善认知功能。

2.2 患者教育计划实施：只有 144 名参与者接受了健康教育 (HE) 会议的邀请。 实际参加人数只有121人。 不参与的原因包括：缺乏兴趣，他们拒绝承诺参加生活方式计划。

2.2.1 面对面和小组讨论 HE 会议鼓励改变生活方式：所有研究的患者都被邀请参加 HE 会议。 在近 2 个月的时间里，NRC 举行了七次会议，解释了这两本设计的小册子。 HE讲座由公共卫生团队主讲，糖尿病专家在小组讨论中分享，对T2DM管理相关问题进行讲解和解答。 HE 程序被提供用于控制 DM，有关对大脑健康重要的食物的信息和不同的智力游戏以提高他们的认知。

2.2.2 教材的分发 准备好的小册子分发给了所有参加者。 参与者被告知这两本小册子在改进他们关于 T2DM 和 MCI 的科学信息方面的重要性。

2.2.3 实验室分析的再评估。 在健康教育时禁食至少 10 小时后，在完全无菌技术下从每位参与者身上抽取 3 毫升血样。 它旨在在干预前评估 FBG、HbA1c 和总血胆固醇，并在干预期间三个月重新评估，以激励患者监测他们因生活方式改变而取得的进展。 每个参与者都被要求亲自从研究团队那里收到他的实验室结果。 这允许讨论他的结果的解释，从而重新鼓励或给他任何需要的建议，以保持他对生活方式改变计划的坚持。

2.2.4 由内分泌科和神经科专家根据实验室结果和患者依从性进行临床随访和管理。

2.2.5 个性化医学营养计划：要求每位参与者完成为期 3 天的食物日记。 通过面对面访谈与每位参与者单独讨论这些问题，以建议和说服他们改变饮食习惯。 每个病人都被教导如何根据实验室分析和碳水化合物计数的结果来调节他的饮食。

2.2.6 还分发了个性化的双周随访计划，作为需要改变的目标健康行为的指南，允许自我监测他们取得的进展。 在 6 个月的时间里，参与者通过手机使用设计的表格进行随访，以评估患者对生活方式改变计划的依从性和坚持性。

2.2.7 WhatsApp电话应用群：欢迎参与者在对生活方式或治疗改变有任何疑问时与研究团队联系。 通过这个小组，录制并分发了 12 条音频信息。 这些信息概括了小册子的内容，以方便患者了解健康教育。 健康习惯的提示以及心理活动的练习也被上传到该组。

2.3.8 临床状态和实验室概况的最终重新评估。 招募六个月后，对持续到研究结束的 98 名参与者进行了面对面访谈。 他们完成了一份最终表格，以评估他们对该计划的遵守情况。 ACE III 测试和 TMT 及其两个部分 A 和 B 测试通过临床、体重和血压重新评估进行重新评估，以评估生活方式改变计划对认知功能的影响。 分别使用 SF-36 和 HRDS 问卷重新评估生活质量和抑郁症。 干预后重新评估 HbA1c 水平、血脂谱、氧化剂和抗氧化剂的实验室分析。