Diabetes Mellitus e microRNA como Fatores de Risco para Comprometimento Cognitivo Leve: Impacto da Modificação do Estilo de Vida

O presente estudo foi realizado durante o período de fevereiro de 2016 a junho de 2019 em duas etapas.

1. Primeira etapa (avaliação inicial): Foi um estudo transversal realizado em 163 pacientes com Diabetes Mellitus tipo 2 (T2DM) atendidos em ambulatórios no NRC. Os pacientes eram 65 homens e 98 mulheres; idade de 40 a 65 anos. Todos os pacientes eram alfabetizados e conseguiram completar os testes de função cognitiva. Os critérios de exclusão foram pacientes com DM2 com histórico de traumatismo craniano, acidente vascular cerebral, ataque isquêmico transitório, tumor cerebral, epilepsia, doença psiquiátrica, insuficiência cardíaca ou hepática e deficiência visual ou auditiva. A aprovação do comitê de ética do NRC foi obtida com o número de registro 15131. Os participantes assinaram um consentimento informado por escrito antes de serem incluídos no estudo.

1.1 Uma entrevista face a face foi realizada com todos os participantes para coletar dados sobre dados demográficos, histórico médico e função cognitiva. Os dados incluíram idade, sexo, nível de escolaridade e tabagismo. A história médica detalhada do diabetes foi coletada dos pacientes, incluindo a idade do diagnóstico de diabetes, frequência dos ataques hipoglicêmicos, tipo de tratamento (insulina ou hipoglicemiante oral), história de hipertensão, dislipidemia ou outras doenças e medicamentos tomados. Qualquer queixa sugestiva de presença de neuropatia periférica sensorial, como formigamento, dor em queimação ou dormência nas mãos e nos pés, foi registrada. Todos os participantes estudados foram submetidos a exame clínico minucioso, avaliação da pressão arterial sistólica e diastólica e avaliação antropométrica (medidas de peso e altura).

1.2 A avaliação da função cognitiva com seus domínios foi realizada por meio do teste Adenbrooke's Cognitive Examination III (ACE III), que avalia cinco domínios cognitivos: atenção, memória, fluência verbal, linguagem e habilidades visuoespaciais. É a escala cognitiva de forma árabe mais confiável e validada e disponível gratuitamente para ser aplicada. O comprometimento cognitivo leve objetivo (CCL) foi considerado se o escore ACE III for inferior a 88. O Trail Making Test (TMT) também foi utilizado. O TMT é um dos instrumentos mais utilizados na avaliação neuropsicológica como indicador da velocidade do processamento cognitivo e do funcionamento executivo. Ele avalia a atenção, a concentração, a velocidade psicomotora, a mudança cognitiva e a função sequencial complexa, medindo o tempo necessário para conectar uma série de círculos numerados sequencialmente e com letras. O teste consiste em duas partes (A e B). A pontuação direta de cada parte é representada pelo tempo de conclusão das tarefas. Tempo mais curto indica melhor função cognitiva.

1.3 Foi utilizada a Escala de Avaliação de Hamilton para Depressão (HRSD), é uma das escalas mais utilizadas que classificam objetivamente a gravidade da depressão. A escala inclui 17 itens, cada um é pontuado em uma escala de 3 ou 5 pontos, sendo o escore final indicativo da gravidade da depressão do paciente. A classificação do nível de depressão foi realizada de acordo com o National Institute for Health & Clinical Excellence do Reino Unido (Reino Unido) (0-7 = Normal, 8-13 = Depressão leve, 14-18 = Depressão moderada, 19-22 = Depressão grave e ≥ 23 = Depressão muito grave).

1.4 A avaliação da qualidade de vida relacionada à saúde (QVRS) foi realizada por meio do questionário Short Form-36 (SF-36). O questionário contém 36 itens compreendendo oito domínios do estado de saúde que são função física (PF), função física (RP), dor corporal (BP), percepção geral de saúde GH), vitalidade (VT), função social (SF), função emocional (RE) e saúde mental (SM). A pontuação de cada domínio é de 0 a 100, sendo a pontuação '100' a melhor classificação de saúde. Foi utilizada a versão árabe do questionário.

1.5 Avaliação do estilo de vida de pacientes com DM2. Os pacientes receberam um questionário elaborado para avaliar seu estilo de vida em relação a hábitos alimentares, atividades físicas, sociais e mentais e a opinião sobre a melhor forma de motivá-los para a mudança de estilo de vida.

1.6 Análise laboratorial de linha de base. Cinco ml de amostra de sangue foram retirados sob técnica asséptica completa de cada participante, após jejum de pelo menos 10 horas no início do estudo. Foi dividido em tubos vacutainer de ácido etileno diamina tetra acético (EDTA) seco e lavanda. O nível de hemoglobina glicada (HbA1c) e o colesterol total no sangue foram avaliados usando o analisador químico Olympus-au-400. As concentrações de malondialdeído (MDA) no soro foram determinadas usando kit ELISA com base na técnica de imunoensaio enzimático de ligação competitiva. Os eritrócitos foram examinados quanto à atividade antioxidante enzimática da catalase, glutationa peroxidase (GPx) e glutationa redutase (GR).

1.7 Para análise da expressão de miRNAs: O sangue foi coletado em tubos especiais de preservação de RNA; invertido 8-10 vezes e, em seguida, armazenado congelado a -80°C para posterior extração de RNA. O isolamento do RNA e a estimativa da qualidade do RNA foram empregados antes de iniciar a caracterização da expressão do miRNA. Apenas 1-10 nano gramas de RNA total purificado ou equivalente foi suficiente para quantificar de forma confiável os miRNAs de interesse. As concentrações de miRNAs selecionadas neste estudo foram determinadas pelo ensaio quantitativo TaqMan miRNA em tempo real (qRT) de reação em cadeia da polimerase (PCR) de alvo único (Applied Biosystems) nas amostras de plasma de acordo com as instruções do fabricante. Foi aplicado um protocolo de duas etapas que requer apenas a transcrição reversa com um primer específico para miRNA, seguida de PCR em tempo real com sondas TaqMan. O TaqMan MicroRNA Assays é um iniciador de transcrição reversa de estrutura de haste-laço específica para o alvo. A haste-alça atinge dois objetivos: 1) especificidade apenas para o alvo de miRNA maduro e 2) formação de um iniciador de transcriptase reversa (RT)/miRNA-quimera maduro, estendendo a extremidade 5' do miRNA. As reações de RT contendo amostras de RNA, looped-primers, tampão 1 X, transcriptase reversa e inibidor de RNase serão incubadas por 30 min cada, a 16°C e a 42°C. O amplicon RT mais longo resultante apresenta um modelo passível de PCR em tempo real padrão, usando ensaios TaqMan. Em seguida, a PCR em tempo real foi realizada no instrumento de PCR em tempo real Quant Studio 12 K Flex.

Segunda etapa (ensaio de intervenção): Esta etapa foi um estudo de intervenção para educação em saúde e modificação do estilo de vida. Foi realizado para Implementação do programa de modificação do estilo de vida em pacientes com DM2.

2.1 Criação de dois folhetos educativos em saúde Depois de identificar as necessidades dos participantes com DM2, a equipe de pesquisa elaborou dois livretos educativos em saúde. A primeira cartilha intitulada "Diabetes mellitus e como controlar suas complicações". O livreto inclui informações sobre a doença T2DM e como ela afeta diferentes sistemas do corpo levando a complicações do Diabetes Mellitus (DM). Inclui também informações sobre níveis normais e anormais de glicemia de jejum e hemoglobina glicada (HbA1c). Demonstra como controlar e prevenir as complicações do DM, enfatizando a nutrição saudável e a contagem de carboidratos, atividades físicas, adesão estrita ao regime médico e evitando o estresse. A segunda cartilha intitulada "Comprometimento cognitivo leve e como prevenir" inclui informações sobre definição de função cognitiva, CCL e Alzheimer e sua relação com DM2 e fatores de risco para comprometimento cognitivo e como controlar e melhorar a função cognitiva.

2.2 Implementação do programa de educação do paciente: Apenas 144 participantes aceitaram o convite para participar das sessões de educação em saúde (ES). O número real de participantes foi de apenas 121. As razões para a não participação incluem: falta de interesse e recusa de compromisso com o programa de estilo de vida.

2.2.1 Sessões de EH face a face e discussão em grupo para encorajar a modificação do estilo de vida: Todos os doentes estudados foram convidados a assistir às sessões de EH. Sete sessões foram realizadas no NRC durante um período de quase 2 meses, explicando os dois livretos projetados. As palestras do HE foram apresentadas pela equipe de saúde pública e por um especialista em diabetes que participou da discussão em grupo para explicar e responder às questões relacionadas ao manejo do DM2. O programa HE foi fornecido para controle do DM, informações sobre alimentos importantes para a saúde do cérebro e diferentes jogos intelectuais para melhorar sua cognição.

2.2.2 Divulgação de Materiais Educativos As cartilhas elaboradas foram distribuídas a todos os participantes. Os participantes foram informados sobre a importância dessas duas cartilhas para melhorar suas informações científicas sobre DM2 e CCL.

2.2.3 Reavaliação das análises laboratoriais. Três ml de amostra de sangue foram retirados sob técnica asséptica completa de cada participante, após jejum de pelo menos 10 horas no momento da educação em saúde. Teve como objetivo avaliar FBG, HbA1c e colesterol total no sangue imediatamente antes da intervenção e foram reavaliados três meses durante a intervenção para ser um incentivo para os pacientes como um monitoramento do progresso obtido devido à modificação do estilo de vida. Cada participante foi convidado a receber seus resultados de laboratório pessoalmente da equipe de pesquisa. Isso permitiu discutir a interpretação de seus resultados e, assim, reencorajá-lo ou dar-lhe qualquer conselho necessário para manter sua adesão ao programa de modificação do estilo de vida.

2.2.4 O acompanhamento clínico e o manejo foram realizados por especialistas em endocrinologia e neurologia, dependendo dos resultados laboratoriais e da adesão do paciente.

2.2.5 Programa de Nutrição Médica Individualizada: Cada participante foi solicitado a preencher um diário alimentar de 3 dias. Estas foram discutidas individualmente com cada participante através de uma entrevista face a face, de forma a aconselhá-los e convencê-los a mudar os seus hábitos alimentares . Cada paciente foi ensinado como ele pode regular sua dieta dependendo do resultado da análise laboratorial e da contagem de carboidratos.

2.2.6 Esquema individualizado de acompanhamento quinzenal também foi distribuído como um guia para os comportamentos saudáveis ​​direcionados a serem alterados, o que permitiu o automonitoramento de seu progresso alcançado. Durante um período de 6 meses, os participantes foram acompanhados por telefone celular, usando folha desenhada, para avaliar a adesão dos pacientes ao programa de modificação do estilo de vida.

2.2.7 Grupo de aplicação do telefone WhatsApp: Os participantes foram convidados a entrar em contato com a equipe de pesquisa sempre que tivessem qualquer dúvida sobre estilo de vida ou modificações no tratamento. Por meio desse grupo, foram gravadas e distribuídas 12 mensagens de áudio. Essas mensagens resumiam o conteúdo da cartilha, para ser uma forma de fácil acesso para os pacientes para ajudá-los a seguir a educação em saúde. Dicas para hábitos saudáveis, bem como exercícios para atividades mentais também foram enviados para este grupo.

2.3.8 Reavaliação final do quadro clínico e perfil laboratorial. Seis meses após o recrutamento, uma entrevista face a face foi realizada com os 98 participantes que continuaram até o final do estudo. Eles preencheram uma folha final para avaliar sua adesão ao programa. O teste ACE III e o TMT com suas duas partes A e B foram reavaliados com reavaliação clínica, de peso e pressão arterial para avaliar o impacto do programa de modificação do estilo de vida na função cognitiva. A qualidade de vida e a depressão foram reavaliadas por meio dos questionários SF-36 e HRDS, respectivamente. Análises laboratoriais para nível de HbA1c, perfil lipídico, oxidante e antioxidante foram reavaliadas após a intervenção.