Diabete mellito e microRNA come fattori di rischio per un lieve deterioramento cognitivo: impatto della modifica dello stile di vita

Il presente studio è stato condotto durante il periodo da febbraio 2016 a giugno 2019 in due fasi.

1. Primo passo (valutazione di base): si trattava di uno studio trasversale condotto su 163 pazienti con diabete mellito di tipo 2 (T2DM) che frequentavano cliniche ambulatoriali presso NRC. I pazienti erano 65 maschi e 98 femmine; età compresa tra 40 e 65 anni. Tutti i pazienti erano alfabetizzati e sono stati in grado di completare i test della funzione cognitiva. I criteri di esclusione erano pazienti con diabete di tipo 2 con storia di trauma cranico, ictus, attacco ischemico transitorio, tumore cerebrale, epilessia, malattia psichiatrica, insufficienza cardiaca o epatica e disabilità visive o uditive. L'approvazione del comitato etico NRC è stata ottenuta con il numero di registrazione 15131. I partecipanti hanno firmato un consenso informato scritto prima di essere inclusi nello studio.

1.1 È stata condotta un'intervista faccia a faccia con tutti i partecipanti per raccogliere dati su dati demografici, anamnesi e funzione cognitiva. I dati includevano età, sesso, livello di istruzione e fumo di tabacco. L'anamnesi medica dettagliata del diabete è stata presa dai pazienti includendo l'età della diagnosi del diabete, la frequenza degli attacchi ipoglicemici, il tipo di trattamento (insulina o farmaco ipoglicemizzante orale), la storia di ipertensione, dislipidemia o altre malattie e farmaci assunti. È stato registrato qualsiasi reclamo indicativo della presenza di neuropatia periferica sensoriale come formicolio, bruciore o intorpidimento alle mani e ai piedi. Tutti i partecipanti studiati sono stati sottoposti ad esame clinico approfondito, pressione arteriosa sistolica e diastolica e valutazione antropometrica (misurazioni di peso e altezza).

1.2 La valutazione della funzione cognitiva con i suoi domini è stata effettuata utilizzando il test Cognitive Examination III (ACE III) di Adenbrooke che valuta cinque domini cognitivi: attenzione, memoria, fluidità verbale, linguaggio e abilità visuospaziali. È la scala cognitiva della forma araba più affidabile e validata e liberamente disponibile per essere applicata. Il deterioramento cognitivo obiettivo lieve (MCI) è stato considerato se il punteggio ACE III è inferiore a 88. È stato utilizzato anche il Trail Making Test (TMT). La TMT è uno degli strumenti più utilizzati nella valutazione neuropsicologica come indicatore della velocità dell'elaborazione cognitiva e del funzionamento esecutivo. Valuta l'attenzione, la concentrazione, la velocità psicomotoria, lo spostamento cognitivo e la complessa funzione di sequenziamento misurando il tempo necessario per collegare una serie di cerchi numerati in sequenza e con lettere. Il test si compone di due parti (A e B). Il punteggio diretto di ciascuna parte è rappresentato dal tempo di completamento dei compiti. Un tempo più breve indica una migliore funzione cognitiva.

1.3 È stata utilizzata la Hamilton Rating Scale for Depression (HRSD), una delle scale più utilizzate che valuta oggettivamente la gravità della depressione. La scala comprende 17 item, ognuno dei quali è valutato su una scala di 3 o 5 punti, con il punteggio finale indicativo della gravità della depressione del paziente. La classificazione del livello di depressione è stata effettuata in base al National Institute for Health & Clinical Excellence del Regno Unito (UK) (0-7 = Normale, 8-13 = Lieve depressione, 14-18 = Moderata depressione, 19-22 = Depressione grave e ≥ 23 = Depressione molto grave).

1.4 La valutazione della qualità della vita correlata alla salute (HRQOL) è stata effettuata utilizzando il questionario Short Form-36 (SF-36). Il questionario contiene 36 item comprendenti otto domini dello stato di salute che sono funzionamento fisico (FP), ruolo fisico (RP), dolore corporeo (BP), percezione generale della salute GH), vitalità (VT), funzionamento sociale (SF), ruolo emotivo (RE) e salute mentale (MH). Il punteggio di ogni dominio va da 0 a 100, con un punteggio di '100' come migliore valutazione della salute. È stata utilizzata la versione araba del questionario.

1.5 Valutazione dello stile di vita dei pazienti con T2DM. Ai pazienti è stato somministrato un questionario progettato per valutare il loro stile di vita per quanto riguarda le abitudini alimentari, le attività fisiche, sociali e mentali e l'opinione sul modo migliore per motivarli a cambiare stile di vita.

1.6 Basale Analisi di laboratorio. Cinque ml di campione di sangue sono stati prelevati con tecnica asettica completa da ciascun partecipante, dopo un digiuno di almeno 10 ore all'inizio dello studio. È stato diviso in provette vacutainer di acido etilendiamminotetracetico (EDTA) secco e lavanda. Il livello di emoglobina glicata (HbA1c) e il colesterolo totale nel sangue sono stati valutati utilizzando l'autoanalizzatore chimico Olympus-au-400. Le concentrazioni di malondialdeide (MDA) nel siero sono state determinate utilizzando il kit ELISA basato sulla tecnica di immunodosaggio enzimatico competitivo. Gli eritrociti sono stati esaminati per l'attività antiossidante enzimatica di catalasi, glutatione perossidasi (GPx) e glutatione reduttasi (GR).

1.7 Per l'analisi dell'espressione dei miRNA: il sangue è stato prelevato in speciali provette per la conservazione dell'RNA; capovolto 8-10 volte e quindi conservato congelato a -80°C per un'ulteriore estrazione dell'RNA. L'isolamento dell'RNA e la stima della qualità dell'RNA sono stati impiegati prima di iniziare la caratterizzazione dell'espressione del miRNA. Solo 1-10 nanogrammi di RNA totale purificato o equivalente erano sufficienti per quantificare in modo affidabile i miRNA di interesse. Le concentrazioni di miRNA selezionati in questo studio sono state determinate dal test di reazione a catena della polimerasi (PCR) quantitativa in tempo reale (qRT) TaqMan miRNA a bersaglio singolo (Applied Biosystems) nei campioni di plasma secondo le istruzioni del produttore. È stato applicato un protocollo in due fasi che richiede solo la trascrizione inversa con un primer specifico per miRNA, seguito da PCR in tempo reale con sonde TaqMan. Il TaqMan MicroRNA Assays è un primer di trascrizione inversa della struttura stem-loop specifico per il target. Lo stem-loop raggiunge due obiettivi: 1) specificità solo per il bersaglio del miRNA maturo e 2) formazione di un primer/miRNA-chimera maturo della trascrittasi inversa (RT), che estende l'estremità 5' del miRNA. Le reazioni RT contenenti campioni di RNA, primer ad anello, 1 tampone X, trascrittasi inversa e inibitore della RNasi saranno incubate per 30 minuti ciascuna, a 16°C ea 42°C. L'amplicone RT più lungo risultante presenta un modello suscettibile di PCR in tempo reale standard, utilizzando i saggi TaqMan. Quindi la PCR in tempo reale è stata eseguita sullo strumento per PCR in tempo reale Quant Studio 12 K Flex.

Seconda fase (prova interventistica): questa fase è stata uno studio interventistico per l'educazione alla salute e la modifica dello stile di vita. È stato condotto per implementare il programma di modifica dello stile di vita sui pazienti con T2DM.

2.1 Progettazione di due opuscoli di educazione sanitaria Dopo aver identificato i bisogni dei partecipanti al T2DM, il team di ricerca ha progettato due opuscoli di educazione sanitaria. Il primo opuscolo intitolato "Diabete mellito e come controllarne le complicanze". L'opuscolo include informazioni sulla malattia del diabete di tipo 2 e su come colpisce i diversi sistemi del corpo che portano alle complicanze del diabete mellito (DM). Include anche informazioni sul livello normale e anomalo di glicemia a digiuno e di emoglobina glicata (HbA1c). Dimostra come controllare e prevenire le complicanze del DM, sottolineando un'alimentazione sana e il conteggio dei carboidrati, attività fisiche, stretta aderenza al regime medico ed evitando lo stress. Il secondo opuscolo intitolato "Deterioramento cognitivo lieve e come prevenirlo" include informazioni sulla definizione della funzione cognitiva, MCI e Alzheimer e la sua relazione con T2DM e fattori di rischio per il deterioramento cognitivo e come controllare e migliorare la funzione cognitiva.

2.2 Attuazione del programma di educazione del paziente: solo 144 partecipanti hanno accettato l'invito a partecipare alle sessioni di educazione alla salute (HE). Il numero effettivo che ha partecipato era solo 121. Le ragioni della mancata partecipazione includono: mancanza di interesse e rifiuto dell'impegno nel programma sullo stile di vita.

2.2.1 Sessioni di discussione faccia a faccia e di gruppo HE per incoraggiare la modifica dello stile di vita: tutti i pazienti studiati sono stati invitati a partecipare alle sessioni HE. Sette sessioni si sono tenute presso NRC per un periodo di quasi 2 mesi per spiegare i due opuscoli progettati. Le lezioni di HE sono state presentate dal team di sanità pubblica e da un esperto di diabete che ha partecipato alla discussione di gruppo per spiegare e rispondere alle domande relative alla gestione del T2DM. È stato fornito il programma HE per il controllo della DM, informazioni sugli alimenti importanti per la salute del cervello e diversi giochi intellettuali per migliorare la loro cognizione.

2.2.2 Diffusione del materiale didattico I libretti preparati sono stati distribuiti a tutti i partecipanti. I partecipanti sono stati informati dell'importanza di questi due opuscoli per migliorare le loro informazioni scientifiche su T2DM e MCI.

2.2.3 Rivalutazione delle analisi di laboratorio. Tre ml di campione di sangue sono stati prelevati con tecnica asettica completa da ciascun partecipante, dopo un digiuno di almeno 10 ore al momento dell'educazione sanitaria. Mirava a valutare FBG, HbA1c e colesterolo totale nel sangue poco prima dell'intervento e sono stati rivalutati tre mesi durante l'intervento per essere un incentivo per i pazienti come monitoraggio dei progressi raggiunti grazie alla modifica dello stile di vita. Ad ogni partecipante è stato chiesto di ricevere personalmente i suoi risultati di laboratorio dal gruppo di ricerca. Ciò ha permesso di discutere l'interpretazione dei suoi risultati e quindi incoraggiarlo nuovamente o dargli tutti i consigli necessari per mantenere la sua adesione al programma di modifica dello stile di vita.

2.2.4 Il follow-up clinico e la gestione sono stati effettuati da specialisti in endocrinologia e neurologia in base ai risultati di laboratorio e alla compliance del paziente.

2.2.5 Programma di nutrizione medica individualizzato: a ciascun partecipante è stato chiesto di completare un diario alimentare di 3 giorni. Questi sono stati discussi individualmente con ciascun partecipante attraverso un'intervista faccia a faccia al fine di consigliarli e convincerli a cambiare le loro abitudini alimentari. Ad ogni paziente è stato insegnato come regolare la propria dieta in base al risultato delle analisi di laboratorio e al conteggio dei carboidrati.

2.2.6 È stato inoltre distribuito uno schema di follow-up bisettimanale individualizzato come guida per i comportamenti sani mirati che dovevano essere modificati, il che ha consentito l'automonitoraggio dei progressi raggiunti. Per un periodo di 6 mesi, i partecipanti sono stati seguiti tramite telefono cellulare, utilizzando un foglio progettato, per valutare la compliance e l'adesione dei pazienti al programma di modifica dello stile di vita.

2.2.7 Gruppo di applicazioni telefoniche WhatsApp: i partecipanti sono stati invitati a contattare il gruppo di ricerca ogni volta che avevano domande riguardanti lo stile di vita o le modifiche al trattamento. Attraverso questo gruppo sono stati registrati e distribuiti 12 messaggi audio. Questi messaggi riassumono il contenuto del libretto, per essere un modo facilmente accessibile ai pazienti per aiutarli a seguire l'educazione sanitaria. In questo gruppo sono stati caricati anche suggerimenti per abitudini sane ed esercizi per attività mentali.

2.3.8 Rivalutazione finale dello stato clinico e del profilo di laboratorio. Sei mesi dopo il reclutamento, è stata effettuata un'intervista faccia a faccia con i 98 partecipanti che è proseguita fino alla fine dello studio. Hanno compilato un foglio finale per valutare la loro conformità al programma. Il test ACE III e il TMT con le sue due parti A e B sono stati rivalutati con rivalutazione clinica, del peso e della pressione arteriosa per valutare l'impatto del programma di modifica dello stile di vita sulla funzione cognitiva. La qualità della vita e la depressione sono state rivalutate utilizzando rispettivamente i questionari SF-36 e HRDS. Le analisi di laboratorio per il livello di HbA1c, il profilo lipidico, l'ossidante e l'antiossidante sono state rivalutate dopo l'intervento.