Diabetes Mellitus a mikroRNA jako rizikové faktory pro mírné kognitivní poruchy: dopad změny životního stylu

Aktuální studie probíhala v období od února 2016 do června 2019 ve dvou krocích.

1. První krok (základní hodnocení): Jednalo se o průřezovou studii provedenou na 163 pacientech s diabetes mellitus 2. typu (T2DM) navštěvujících ambulance NRC. Pacienty bylo 65 mužů a 98 žen; ve věku od 40 do 65 let. Všichni pacienti byli gramotní a byli schopni dokončit testy kognitivních funkcí. Vylučovacími kritérii byli pacienti s T2DM s anamnézou úrazu hlavy, mrtvice, tranzitorní ischemické ataky, mozkového nádoru, epilepsie, psychiatrického onemocnění, srdečního nebo jaterního selhání a zrakového nebo sluchového postižení. Byl získán souhlas etické komise NRC s registračním číslem 15131. Účastníci podepsali písemný informovaný souhlas před zařazením do studie.

1.1 Se všemi účastníky byl proveden osobní rozhovor s cílem shromáždit údaje o demografii, anamnéze a kognitivních funkcích. Údaje zahrnovaly věk, pohlaví, úroveň vzdělání a kouření tabáku. U pacientů byla odebrána podrobná anamnéza diabetu včetně věku diagnózy diabetu, frekvence hypoglykemických záchvatů, typu léčby (inzulín nebo perorální hypoglykemika), anamnézy hypertenze, dyslipidémie nebo jiných onemocnění a užívaných léků. Byla zaznamenána jakákoliv stížnost naznačující přítomnost senzorické periferní neuropatie, jako je brnění, pálivá bolest nebo necitlivost v rukou a nohou. Všichni studovaní účastníci byli podrobeni důkladnému klinickému vyšetření, systolickému a diastolickému krevnímu tlaku a antropometrickému hodnocení (měření hmotnosti a výšky).

1.2 Hodnocení kognitivních funkcí s jejich doménami bylo provedeno pomocí Adenbrooke's Cognitive Examination III (ACE III) testu, který hodnotí pět kognitivních domén: pozornost, paměť, verbální plynulost, jazyk a vizuoprostorové schopnosti. Je to nejspolehlivější a ověřená kognitivní škála arabské formy a je volně dostupná k použití. Objektivní mírná kognitivní porucha (MCI) byla zvažována, pokud je skóre ACE III nižší než 88. Použil se také Trail Making Test (TMT). TMT je jedním z nejpoužívanějších nástrojů v neuropsychologickém hodnocení jako indikátor rychlosti kognitivního zpracování a exekutivního fungování. Hodnotí pozornost, koncentraci, psychomotorickou rychlost, kognitivní posuny a komplexní sekvenční funkce měřením času potřebného k propojení série postupně číslovaných a písmenných kruhů. Test se skládá ze dvou částí (A a B). Přímé skóre každé části je reprezentováno časem dokončení úkolů. Kratší čas ukazuje na lepší kognitivní funkce.

1.3 Byla použita Hamiltonova hodnotící škála pro depresi (HRSD), jedná se o jednu z nejpoužívanějších škál, která objektivně hodnotí závažnost deprese. Škála zahrnuje 17 položek, každá je hodnocena na 3 nebo 5 bodové škále, přičemž konečné skóre ukazuje závažnost pacientovy deprese. Klasifikace úrovně deprese byla provedena v závislosti na National Institute for Health & Clinical Excellence of the United Kingdom (UK) (0-7 = normální, 8-13 = mírná deprese, 14-18 = středně těžká deprese, 19-22 = Těžká deprese a ≥ 23 = velmi těžká deprese).

1.4 Hodnocení kvality života související se zdravím (HRQOL) bylo provedeno pomocí dotazníku Short Form-36 (SF-36). Dotazník obsahuje 36 položek zahrnujících osm domén zdravotního stavu, kterými jsou fyzické fungování (PF), role fyzická (RP), tělesná bolest (BP), celkové vnímání zdraví GH, vitalita (VT), sociální fungování (SF), role emoční (RE) a duševní zdraví (MH). Hodnocení každé domény je od 0 do 100, se skóre '100' jako nejlepší hodnocení zdraví. Byla použita arabská verze dotazníku.

1.5 Hodnocení životního stylu pacientů s T2DM. Pacientům byl poskytnut dotazník, který měl zhodnotit jejich životní styl týkající se výživových návyků, fyzických, sociálních a duševních aktivit a názor na nejlepší způsob, jak je motivovat ke změně životního stylu.

1.6 Základní laboratorní analýza. Každému účastníkovi bylo odebráno 5 ml vzorku krve za úplné aseptické techniky po lačnění po dobu alespoň 10 hodin na začátku studie. Byl rozdělen do vakuových zkumavek s ethylendiamintetraoctovou kyselinou (EDTA) a levandulovým. Hladina glykovaného hemoglobinu (HbA1c) a celkový cholesterol v krvi byly hodnoceny pomocí chemického autoanalyzátoru Olympus-au-400. Koncentrace malondialdehydu (MDA) v séru byly stanoveny pomocí soupravy ELISA založené na technice imunoanalýzy kompetitivního vazebného enzymu. Erytrocyty byly vyšetřeny na enzymatickou antioxidační aktivitu katalázy, glutathionperoxidázy (GPx) a glutathionreduktázy (GR).

1.7 Pro analýzu exprese miRNA: Krev byla odebrána do speciálních zkumavek pro uchování RNA; převrátit 8-10krát a poté uložit zmrazené při -80 °C pro další extrakci RNA. Před zahájením charakterizace exprese miRNA byla použita izolace RNA a odhad kvality RNA. Pouze 1-10 nanogramů vyčištěné celkové RNA nebo ekvivalentu stačilo ke spolehlivé kvantifikaci požadovaných miRNA. Koncentrace miRNA vybraných v této studii byly stanoveny jednoduchým cílem TaqMan miRNA kvantitativním testem polymerázové řetězové reakce (PCR) v reálném čase (qRT) (Applied Biosystems) ve vzorcích plazmy podle pokynů výrobce. Byl použit dvoustupňový protokol, který vyžaduje pouze reverzní transkripci s miRNA-specifickým primerem, následovanou PCR v reálném čase se sondami TaqMan. TaqMan MicroRNA Assays je cílově specifický primer reverzní transkripce se strukturou kmenové smyčky. Vlásenka-loop splňuje dva cíle: 1) specificitu pouze pro cíl zralé miRNA a 2) vytvoření primeru reverzní transkriptázy (RT)/maturované miRNA-chiméry, prodlužující 5' konec miRNA. Reakce RT obsahující vzorky RNA, smyčkové primery, 1 X pufr, reverzní transkriptázu a inhibitor RNázy budou inkubovány po dobu 30 minut, každá při 16 °C a při 42 °C. Výsledný delší amplikon RT představuje templát vhodný pro standardní PCR v reálném čase pomocí testů TaqMan. Poté byla provedena Real-time PCR na Quant Studio 12 K Flex Real-Time PCR Instrument.

Druhý krok (intervenční studie): Tímto krokem byla intervenční studie pro výchovu ke zdraví a úpravu životního stylu. Bylo provedeno k Implementaci programu změny životního stylu u pacientů s T2DM.

2.1 Návrh dvou zdravotně výchovných brožur Po identifikaci potřeb účastníků T2DM navrhl výzkumný tým dvě zdravotně výchovné brožury. První brožurka s názvem „Diabetes mellitus a jak kontrolovat jeho komplikace“. Brožura obsahuje informace o onemocnění T2DM a o tom, jak ovlivňuje různé tělesné systémy, což vede ke komplikacím diabetes mellitus (DM). Zahrnuje také informace o normální a abnormální hladině glykémie nalačno a glykovaného hemoglobinu (HbA1c). Ukazuje, jak kontrolovat a předcházet komplikacím DM, důraz na zdravou výživu a počítání sacharidů, pohybové aktivity, důsledné dodržování léčebného režimu a vyhýbání se stresu. Druhá brožura s názvem „Mírné kognitivní poruchy a jak jim předcházet“ obsahuje informace o definici kognitivních funkcí, MCI a Alzheimerově chorobě a jejich vztahu k T2DM a rizikovým faktorům kognitivní poruchy a jak kontrolovat a zlepšovat kognitivní funkce.

2.2 Realizace programu edukace pacientů: Pouze 144 účastníků přijalo pozvání ke zdravotní výchově (VV). Skutečný počet účastníků byl pouze 121. Mezi důvody neúčasti patří: nezájem a odmítli se zapojit do programu životního stylu.

2.2.1 Osobní a skupinová diskuse Sezení HE na podporu změny životního stylu: Všichni studovaní pacienti byli pozváni k účasti na HE sezeních. Během téměř 2 měsíců se v NRC konalo sedm zasedání, na kterých byly vysvětleny dvě navržené brožury. Přednášky HE byly prezentovány týmem veřejného zdraví a odborníkem na diabetiky, kteří se podíleli na skupinové diskusi, aby vysvětlili a odpověděli na otázky související s managementem T2DM. Program HE byl poskytnut pro kontrolu DM, informace o potravinách důležitých pro zdraví mozku a různé intelektuální hry ke zlepšení jejich kognice.

2.2.2 Šíření výukových materiálů Připravené brožury byly rozdány všem účastníkům. Účastníci byli informováni o důležitosti těchto dvou brožur při zlepšování jejich vědeckých informací o T2DM a MCI.

2.2.3 Přehodnocení laboratorní analýzy. Každému účastníkovi byly odebrány 3 ml vzorku krve za kompletní aseptické techniky po lačnění po dobu nejméně 10 hodin v době zdravotní výchovy. Jeho cílem bylo zhodnotit FBG, HbA1c a celkový cholesterol v krvi těsně před intervencí a byly přehodnoceny tři měsíce během intervence, aby byly pro pacienty podnětem jako sledování pokroku, kterého dosáhli díky úpravě životního stylu. Každý účastník byl požádán, aby své laboratorní výsledky osobně obdržel od výzkumného týmu. To mu umožnilo diskutovat o interpretaci jeho výsledků, a tak ho znovu povzbudit nebo mu poskytnout potřebnou radu, aby udržoval dodržování programu úpravy životního stylu.

2.2.4 Klinické sledování a léčbu prováděl specialista v oboru endokrinologie a neurologie v závislosti na laboratorních výsledcích a compliance pacienta.

2.2.5 Individuální program lékařské výživy: Každý účastník byl požádán, aby vyplnil 3denní stravovací deník. Tyto byly prodiskutovány s každým účastníkem individuálně prostřednictvím osobního rozhovoru s cílem poradit a přesvědčit je, aby změnili své stravovací návyky. Každý pacient byl poučen, jak si může upravit svůj jídelníček v závislosti na výsledku laboratorní analýzy a počtu sacharidů.

2.2.6 Bylo také distribuováno individuální dvoutýdenní sledovací schéma jako vodítko pro cílené zdravé chování, které bylo třeba změnit, což umožnilo sebemonitorování dosaženého pokroku. Po dobu 6 měsíců byli účastníci sledováni prostřednictvím mobilního telefonu pomocí navrženého listu, aby se posoudila compliance pacientů a dodržování programu změny životního stylu.

2.2.7 Skupina telefonických aplikací WhatsApp: Účastníci byli vítáni, aby kontaktovali výzkumný tým, kdykoli měli jakýkoli dotaz týkající se životního stylu nebo úprav léčby. Prostřednictvím této skupiny bylo nahráno a distribuováno 12 zvukových zpráv. Tato sdělení shrnula obsah brožury, aby byla pro pacienty snadno dostupným způsobem, jak jim pomoci se zdravotní výchovou. Do této skupiny byly také nahrány tipy pro zdravé návyky a také cvičení pro duševní aktivity.

2.3.8 Závěrečné přehodnocení klinického stavu a laboratorního profilu. Šest měsíců po náboru byl proveden osobní rozhovor s 98 účastníky, kteří pokračovali až do konce studie. Vyplnili závěrečný list k posouzení jejich souladu s programem. Test ACE III a TMT s jeho dvěma částmi A a B testy byly přehodnoceny s klinickým přehodnocením, přehodnocením hmotnosti a krevního tlaku, aby se vyhodnotil dopad programu změny životního stylu na kognitivní funkce. Kvalita života a deprese byly přehodnoceny pomocí dotazníků SF-36 a HRDS. Po intervenci byly znovu posouzeny laboratorní analýzy na hladinu HbA1c, lipidový profil, oxidant a antioxidant.