Cukrzyca i mikroRNA jako czynniki ryzyka łagodnych zaburzeń poznawczych: wpływ modyfikacji stylu życia

Obecne badanie zostało przeprowadzone w okresie od lutego 2016 do czerwca 2019 w dwóch etapach.

1. Pierwszy krok (ocena wyjściowa): Było to badanie przekrojowe przeprowadzone na 163 pacjentach z cukrzycą typu 2 (T2DM) uczęszczających do przychodni NRC. Pacjentami było 65 mężczyzn i 98 kobiet; w wieku od 40 do 65 lat. Wszyscy pacjenci byli piśmienni i byli w stanie ukończyć testy funkcji poznawczych. Kryteriami wykluczającymi byli pacjenci z cukrzycą typu 2 z wywiadem urazu głowy, udaru mózgu, przemijającego ataku niedokrwiennego, guza mózgu, padaczki, chorób psychicznych, niewydolności serca lub wątroby oraz upośledzenia wzroku lub słuchu. Uzyskano aprobatę komisji etycznej NRC o numerze rejestracyjnym 15131. Uczestnicy podpisali pisemną świadomą zgodę przed włączeniem do badania.

1.1 Ze wszystkimi uczestnikami przeprowadzono wywiad bezpośredni w celu zebrania danych demograficznych, historii medycznej i funkcji poznawczych. Dane obejmowały wiek, płeć, poziom wykształcenia i palenie tytoniu. Od pacjentów zebrano szczegółowy wywiad medyczny obejmujący wiek rozpoznania cukrzycy, częstość napadów hipoglikemii, rodzaj leczenia (insulina lub doustny lek hipoglikemizujący), historię nadciśnienia tętniczego, dyslipidemii lub innych chorób oraz przyjmowane leki. Rejestrowano każdą skargę sugerującą obecność obwodowej neuropatii czuciowej, takiej jak mrowienie, piekący ból lub drętwienie rąk i stóp. Wszyscy badani zostali poddani szczegółowemu badaniu klinicznemu, pomiarowi ciśnienia skurczowego i rozkurczowego oraz ocenie antropometrycznej (pomiar masy ciała i wzrostu).

1.2 Ocenę funkcji poznawczych wraz z ich domenami przeprowadzono za pomocą testu Cognitive Examination III (ACE III) firmy Adenbrooke, który ocenia pięć domen poznawczych: uwagę, pamięć, płynność werbalną, zdolności językowe i wzrokowo-przestrzenne. Jest to najbardziej wiarygodna i sprawdzona arabska skala kognitywna, dostępna do bezpłatnego stosowania. Jeśli wynik ACE III był mniejszy niż 88, brano pod uwagę obiektywne łagodne zaburzenia poznawcze (MCI). Zastosowano również test tworzenia szlaków (TMT). TMT jest jednym z najczęściej stosowanych narzędzi w ocenie neuropsychologicznej jako wskaźnik szybkości przetwarzania poznawczego i funkcjonowania wykonawczego. Ocenia uwagę, koncentrację, szybkość psychomotoryczną, zmiany poznawcze i złożone funkcje sekwencjonowania, mierząc czas potrzebny do połączenia serii kolejno ponumerowanych i oznaczonych literami okręgów. Test składa się z dwóch części (A i B). Bezpośredni wynik każdej części jest reprezentowany przez czas wykonania zadań. Krótszy czas wskazuje na lepszą funkcję poznawczą.

1.3 Zastosowano Skalę Depresji Hamiltona (HRSD), która jest jedną z najczęściej stosowanych skal obiektywnie oceniających nasilenie depresji. Skala składa się z 17 pozycji, z których każda oceniana jest w skali 3 lub 5-punktowej, przy czym końcowy wynik wskazuje na nasilenie depresji pacjenta. Klasyfikacja poziomu depresji została przeprowadzona w zależności od National Institute for Health & Clinical Excellence of the United Kingdom (UK) (0-7 = normalna, 8-13 = łagodna depresja, 14-18 = umiarkowana depresja, 19-22 = ciężka depresja i ≥ 23 = bardzo ciężka depresja).

1.4 Ocenę jakości życia związanej ze zdrowiem (HRQOL) przeprowadzono za pomocą kwestionariusza Short Form-36 (SF-36). Kwestionariusz zawiera 36 pozycji obejmujących osiem domen stanu zdrowia, którymi są funkcjonowanie fizyczne (PF), rola fizyczna (RP), ból ciała (BP), ogólna percepcja zdrowia GH), witalność (VT), funkcjonowanie społeczne (SF), rola emocjonalna (RE) i zdrowia psychicznego (MH). Punktacja każdej domeny wynosi od 0 do 100, z wynikiem „100” jako najlepszą oceną stanu zdrowia. Wykorzystano arabską wersję kwestionariusza.

1.5 Ocena stylu życia chorych na T2DM. Pacjenci otrzymali zaprojektowany kwestionariusz, który miał na celu ocenę ich stylu życia w zakresie nawyków żywieniowych, aktywności fizycznej, społecznej i umysłowej oraz opinii na temat najlepszego sposobu motywowania ich do zmiany stylu życia.

1.6 Wyjściowa analiza laboratoryjna. Od każdego uczestnika, po co najmniej 10-godzinnym poście na początku badania, pobrano 5 ml próbki krwi w warunkach pełnej aseptyki. Podzielono go na suche zwykłe i lawendowe probówki próżniowe z kwasem etylenodiaminotetraoctowym (EDTA). Poziom hemoglobiny glikowanej (HbA1c) i cholesterolu całkowitego we krwi oceniono za pomocą automatycznego analizatora chemicznego Olympus-au-400. Stężenie dialdehydu malonowego (MDA) w surowicy określono za pomocą zestawu ELISA opartego na technice kompetycyjnego testu immunologicznego z enzymem wiążącym. Erytrocyty badano pod kątem enzymatycznej aktywności przeciwutleniającej katalazy, peroksydazy glutationowej (GPx) i reduktazy glutationowej (GR).

1.7 Do analizy ekspresji miRNA: Krew pobrano do specjalnych probówek do konserwacji RNA; odwrócono 8-10 razy, a następnie przechowywano zamrożone w temperaturze -80°C do dalszej ekstrakcji RNA. Izolację RNA i ocenę jakości RNA zastosowano przed rozpoczęciem charakteryzowania ekspresji miRNA. Tylko 1-10 nanogramów oczyszczonego całkowitego RNA lub ekwiwalentu wystarczyło, aby wiarygodnie określić ilościowo miRNA będące przedmiotem zainteresowania. Stężenia miRNA wybranych w tym badaniu określono za pomocą ilościowego testu TaqMan miRNA w czasie rzeczywistym (qRT) łańcuchowej reakcji polimerazy (PCR) (Applied Biosystems) w próbkach osocza zgodnie z instrukcjami producenta. Zastosowano dwuetapowy protokół, który wymaga jedynie odwrotnej transkrypcji ze starterem specyficznym dla miRNA, a następnie PCR w czasie rzeczywistym z sondami TaqMan. TaqMan MicroRNA Assays jest specyficznym dla celu starterem do odwrotnej transkrypcji o strukturze pnia-pętli. Pętla macierzysta spełnia dwa cele: 1) specyficzność tylko dla dojrzałego docelowego miRNA i 2) tworzenie startera odwrotnej transkryptazy (RT) / dojrzałej chimery miRNA, wydłużając koniec 5' miRNA. Reakcje RT zawierające próbki RNA, zapętlone startery, 1 X bufor, odwrotną transkryptazę i inhibitor RNazy będą inkubowane przez 30 minut każda, w temperaturze 16°C i 42°C. Otrzymany dłuższy amplikon RT stanowi matrycę nadającą się do standardowego PCR w czasie rzeczywistym, przy użyciu testów TaqMan. Następnie przeprowadzono PCR w czasie rzeczywistym na aparacie Quant Studio 12 K Flex Real-Time PCR.

Drugi krok (próba interwencyjna): Ten krok był badaniem interwencyjnym dotyczącym edukacji zdrowotnej i modyfikacji stylu życia. Przeprowadzono wdrożenie programu modyfikacji stylu życia pacjentów z T2DM.

2.1 Zaprojektowanie dwóch broszur edukacyjnych na temat zdrowia Po zidentyfikowaniu potrzeb uczestników T2DM, zespół badawczy zaprojektował dwie broszury edukacyjne na temat zdrowia. Pierwsza książeczka zatytułowana „Cukrzyca i jak kontrolować jej powikłania”. Broszura zawiera informacje o chorobie T2DM oraz o tym, jak wpływa ona na różne układy organizmu, prowadząc do powikłań cukrzycy (DM). Zawiera również informacje o prawidłowym i nieprawidłowym poziomie glukozy we krwi na czczo oraz hemoglobiny glikowanej (HbA1c). Pokazuje, jak kontrolować i zapobiegać powikłaniom DM, kładąc nacisk na zdrowe odżywianie i liczenie węglowodanów, aktywność fizyczną, ścisłe przestrzeganie zaleceń lekarskich i unikanie stresu. Druga książeczka zatytułowana „Łagodne upośledzenie funkcji poznawczych i jak im zapobiegać” zawiera informacje na temat definicji funkcji poznawczych, MCI i Alzheimera oraz ich związku z T2DM i czynnikami ryzyka zaburzeń poznawczych oraz jak kontrolować i poprawiać funkcje poznawcze.

2.2 Realizacja programu edukacji pacjentów: Tylko 144 uczestników przyjęło zaproszenie do udziału w sesjach edukacji zdrowotnej (HE). Rzeczywista liczba uczestników to tylko 121. Przyczyną nieuczestniczenia były: brak zainteresowania i odmowa zaangażowania się w program stylu życia.

2.2.1 Dyskusja twarzą w twarz iw grupach Sesje HE mające na celu zachęcenie do zmiany stylu życia: Wszyscy badani pacjenci zostali zaproszeni do udziału w sesjach HE. Siedem sesji odbyło się w NRC w okresie prawie 2 miesięcy, wyjaśniając dwie zaprojektowane broszury. Wykłady HE zostały wygłoszone przez zespół ds. zdrowia publicznego i eksperta diabetyka, którzy uczestniczyli w dyskusji grupowej, aby wyjaśnić i odpowiedzieć na pytania związane z leczeniem T2DM. Zapewniono program HE do kontrolowania DM, informacje o żywności ważnej dla zdrowia mózgu i różne gry intelektualne w celu poprawy ich funkcji poznawczych.

2.2.2 Rozpowszechnianie materiałów edukacyjnych Przygotowane broszury zostały rozdane wszystkim uczestnikom. Uczestnicy zostali poinformowani o znaczeniu tych dwóch broszur w poprawie ich informacji naukowych na temat T2DM i MCI.

2.2.3 Ponowna ocena analizy laboratoryjnej. Od każdego uczestnika, po co najmniej 10-godzinnym poście w czasie edukacji zdrowotnej, pobrano 3 ml próbki krwi w warunkach pełnej aseptyki. Miała ona na celu ocenę FBG, HbA1c i cholesterolu całkowitego we krwi tuż przed interwencją i była ponownie oceniana trzy miesiące w trakcie interwencji, aby stanowić zachętę dla pacjentów jako monitorowanie postępów, jakie osiągnęli dzięki modyfikacji stylu życia. Każdy uczestnik został poproszony o osobiste odebranie wyników badań laboratoryjnych od zespołu badawczego. Pozwoliło to na przedyskutowanie interpretacji jego wyników, a tym samym ponowne zachęcenie lub udzielenie mu wszelkich potrzebnych wskazówek do dalszego przestrzegania programu modyfikacji stylu życia.

2.2.4 Obserwacja kliniczna i leczenie były prowadzone przez specjalistę endokrynologa i neurologa w zależności od wyników badań laboratoryjnych i przestrzegania zaleceń przez pacjenta.

2.2.5 Zindywidualizowany program żywienia medycznego: Każdy uczestnik został poproszony o wypełnienie 3-dniowego dziennika żywieniowego. Zostały one omówione z każdym uczestnikiem indywidualnie w drodze wywiadu twarzą w twarz, aby doradzić i przekonać ich do zmiany nawyków żywieniowych. Każdy pacjent został nauczony, w jaki sposób może regulować swoją dietę w zależności od wyniku analizy laboratoryjnej i liczby węglowodanów.

2.2.6 Rozprowadzono również zindywidualizowany dwutygodniowy program obserwacji jako przewodnik po docelowych zdrowych zachowaniach, które należy zmienić, co umożliwiło samokontrolę osiągniętych postępów. Przez okres 6 miesięcy uczestnicy byli obserwowani przez telefon komórkowy, przy użyciu zaprojektowanego arkusza, w celu oceny przestrzegania przez pacjentów i przestrzegania programu modyfikacji stylu życia.

2.2.7 Grupa aplikacji WhatsApp na telefon: Uczestnicy byli zachęcani do kontaktowania się z zespołem badawczym za każdym razem, gdy mieli jakiekolwiek pytania dotyczące stylu życia lub modyfikacji leczenia. Za pośrednictwem tej grupy nagrano i rozprowadzono 12 wiadomości dźwiękowych. Komunikaty te podsumowywały treść broszury, aby w łatwo dostępny sposób pomóc pacjentom w realizacji edukacji zdrowotnej. Do tej grupy przesłano również wskazówki dotyczące zdrowych nawyków, a także ćwiczenia na aktywność umysłową.

2.3.8 Ostateczna ponowna ocena stanu klinicznego i profilu laboratoryjnego. Sześć miesięcy po rekrutacji przeprowadzono bezpośrednią rozmowę z 98 uczestnikami, którzy kontynuowali ją do końca badania. Wypełnili końcowy arkusz, aby ocenić ich zgodność z programem. Test ACE III i TMT wraz z dwiema częściami testów A i B zostały ponownie ocenione z ponowną oceną kliniczną, masy ciała i ciśnienia krwi w celu oceny wpływu programu modyfikacji stylu życia na funkcje poznawcze. Jakość życia i depresję oceniono ponownie za pomocą odpowiednio kwestionariuszy SF-36 i HRDS. Analizy laboratoryjne poziomu HbA1c, profilu lipidowego, utleniacza i przeciwutleniacza zostały ponownie ocenione po interwencji.