代谢失调作为虚弱的生物标志物：线粒体功能障碍的作用 (FRAMITO)
这项观察性研究的目的是评估与氧化应激相关的线粒体功能障碍的存在及其在衰弱中可能的作用，无论是否患有多种疾病，并确定与线粒体功能障碍相关的可能的衰弱生物标志物。 它旨在回答的主要问题是：
- 考虑到与多种疾病的相互作用，氧化应激相关的线粒体功能障碍在衰弱中的作用是什么。
- 在评估虚弱时与线粒体功能障碍相关的特定生物标志物可能是什么？
为了实现研究目标，我们将招募三类老年人：
- 无多重病态的非脆弱 (NFWoM)；
- 患有多种疾病的虚弱 (FWM)；
- 虚弱无多重病 (FWoM)。
每个人都将接受虚弱表型和多发病的评估，并收集血液样本以分离外周血单核细胞 (PBMC)。 将通过结合基于非靶向代谢组学的方法和对 PBMC 及其亚群进行的特定线粒体功能障碍的功能研究来识别每组参与者的虚弱生物标志物。 多变量统计和机器学习技术将根据分子数据描述三个临床表型组的特征。
研究概览
详细说明
研究类型：观察性前瞻性研究。 主要目的：评估与氧化应激相关的线粒体功能障碍的存在及其在患有或不患有多种疾病的衰弱中可能的作用。
主要终点：虚弱时线粒体功能障碍。 次要目标：结合基于非靶向代谢组学的方法和对 PBMC 和 PBMC 亚群（B 淋巴细胞、T 淋巴细胞和单核细胞）进行的特定线粒体功能障碍的功能研究。
研究活动按以下任务组织：
- 任务 1，患者招募：我们将从老年门诊或老年病房招募 65 岁或以上的患者。 我们将对每个人进行虚弱和多重疾病评估，并收集血液样本以分离外周血单核细胞 (PBMC)。 将招募三类个体：25 名无多重病的非虚弱个体 (NFWoM)、25 名患有多重病的虚弱个体 (FWM) 和 25 名无多重病的虚弱个体 (FWoM)。
- 任务 2，PBMC 亚群的分离：将使用用于荧光激活细胞分选 (FACS) 分离的细胞分选设备和 MoFlo Astrios 细胞分选仪从冷冻 PBMC 中分离 T 淋巴细胞、B 淋巴细胞和单核细胞。 CD45+/CD3+/CD19-/CD14- T 淋巴细胞、CD45+/CD3-/CD19+/CD14- B 淋巴细胞、CD45+/CD3-/CD19-/CD14+ 单核细胞分析。
- 任务 3，PBMC 和 PBMC 亚群的线粒体功能障碍分析：对于每个个体，将通过分析 mtDNA 损伤（通过实时 PCR）、线粒体质量改变（通过 Mitotracker 染色）以及细胞内和线粒体活性氧（通过分析）来评估线粒体功能障碍（通过通过 DCF 和 MitoSOX 染色）。 此外，我们将使用安捷伦 Seahorse 细胞外通量分析仪 XFe96 评估糖酵解和线粒体代谢的变化。
- 任务 4，PBMC 和 PBMC 亚群的非靶向代谢组学：为了评估 PBMC 和亚群的代谢特征并突出与虚弱相关的代谢失调，我们将对 PBMC、T 淋巴细胞、B 淋巴细胞和单核细胞进行基于 LC-MS 的非靶向代谢组学。 对极性代谢组的分析将使我们能够更好地了解与线粒体失调相关的代谢改变。
- 任务 5，虚弱生物标志物和分子机制的表征：将使用分子、代谢和临床数据的统计和机器学习技术来研究虚弱的潜在生物标志物和涉及线粒体功能障碍的分子机制。 此步骤将有助于根据分子测量来表征临床表型。
研究类型
注册 (估计的)
联系人和位置
学习联系方式
- 姓名：Caterina Trevisan, PhD
- 电话号码：00393896743650
- 邮箱：caterina.trevisan@unife.it
参与标准
资格标准
适合学习的年龄
- 年长者
接受健康志愿者
取样方法
研究人群
描述
纳入标准：
- 年龄≥65岁
- 临床状况稳定
- 参与研究的意愿（提供知情同意书）
- 熟练掌握意大利语
排除标准：
- 急性或不稳定的临床状况
学习计划
研究是如何设计的？
设计细节
队列和干预
团体/队列 |
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无多重病态的非衰弱 (NFWoM)
年龄 65 岁或以上、无虚弱且无多种疾病的个人。
该组将为身体不虚弱且没有多种慢性病的参与者提供参考。
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患有多种疾病的虚弱 (FWM)
65 岁或以上患有多种疾病的体弱人士。
该组将包括表现出虚弱并患有两种或多种慢性疾病的参与者。
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无多重疾病的虚弱 (FWoM)
65 岁或以上的体弱人士，无多种疾病。
该小组将有助于在没有多种慢性病的情况下评估虚弱程度。
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研究衡量的是什么？
主要结果指标
结果测量 |
措施说明 |
大体时间 |
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患有和不患有多重疾病的体弱个体之间线粒体DNA拷贝数的差异
大体时间：基线
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使用 JetQuick™ 血液和细胞培养 DNA Midiprep 试剂盒 (Invitrogen) 从参与者处获得的总 PBMC 以及 T 和 B 淋巴细胞和单核细胞中分离出的 mtDNA 副本，以及 10 ng DNA 将用于在 QuantumStudio 7 实时 PCR 上进行分析（应用生物系统公司）。 mtDNA 拷贝数将通过将线粒体 ND1 基因 (mtND1) 水平标准化为核 Beta-2 微球蛋白 (B2M) 水平来计算。 将比较患有虚弱和多重病的个体与患有虚弱但不患有多重病的个体之间的线粒体DNA拷贝数。 虚弱将根据以下至少三个标准得出：非自愿体重减轻 ≥ 4.5 kg、通过握力测量肌肉无力、每周自我报告疲劳 ≥ 3 天、身体活动量低（通过 IPAQ 问卷评估）、步态速度降低（通过 4 米步行测试测量）。 多重发病被定义为至少存在两种慢性疾病。 |
基线
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非虚弱个体与无多重疾病的虚弱个体之间 mtDNA 拷贝数的差异
大体时间：基线
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使用 JetQuick™ 血液和细胞培养 DNA Midiprep 试剂盒 (Invitrogen) 从参与者处获得的总 PBMC 以及 T 和 B 淋巴细胞和单核细胞中分离出的 mtDNA 副本，以及 10 ng DNA 将用于在 QuantumStudio 7 实时 PCR 上进行分析（应用生物系统公司）。 mtDNA 拷贝数将通过将线粒体 ND1 基因 (mtND1) 水平标准化为核 Beta-2 微球蛋白 (B2M) 水平来计算。 将比较患有虚弱和多重病的个体与患有虚弱但不患有多重病的个体之间的线粒体DNA拷贝数。 虚弱将根据以下至少三个标准得出：非自愿体重减轻 ≥ 4.5 kg、通过握力测量肌肉无力、每周自我报告疲劳 ≥ 3 天、身体活动量低（通过 IPAQ 问卷评估）、步态速度降低（通过 4 米步行测试测量）。 多重发病被定义为至少存在两种慢性疾病。 |
基线
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次要结果测量
结果测量 |
措施说明 |
大体时间 |
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非虚弱个体与无多重疾病的虚弱个体之间线粒体荧光平均强度的变化
大体时间：基线
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从研究参与者获得的 500,000 个 PBMC 将用 CD45、CD3、CD19 和 CD14 抗体染色，并与 100 nM Mitotracker Deep Red (Thermo Fisher Scientific) 在 30°C 下孵育 30 分钟。
细胞还将用活/死染料标记，并使用 MoFLO Astrios 细胞分选仪通过流式细胞术进行分析。
线粒体质量以 Mitotracker Deep Red 的中位荧光强度 (MFI) 进行评估，将在总 PBMC、T 和 B 淋巴细胞以及单核细胞中进行评估。
将获取每个群体门中的 40,000 个事件，并使用 Kaluza 软件进行离线分析。
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基线
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患有和不患有多种疾病的体弱个体之间线粒体荧光平均强度的变化
大体时间：基线
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从研究参与者获得的 500,000 个 PBMC 将用 CD45、CD3、CD19 和 CD14 抗体染色，并与 100 nM Mitotracker Deep Red (Thermo Fisher Scientific) 在 30°C 下孵育 30 分钟。
细胞还将用活/死染料标记，并使用 MoFLO Astrios 细胞分选仪通过流式细胞术进行分析。
线粒体质量以 Mitotracker Deep Red 的中位荧光强度 (MFI) 进行评估，将在总 PBMC、T 和 B 淋巴细胞以及单核细胞中进行评估。
将获取每个群体门中的 40,000 个事件，并使用 Kaluza 软件进行离线分析。
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基线
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非虚弱个体与无多重疾病的虚弱个体之间细胞内活性氧 (ROS) 的差异
大体时间：基线
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荧光细胞渗透指示剂 2',7'-二氯荧光素二乙酸酯 (DCFH-DA) 将用于检测细胞内 ROS。
DCFH-DA 被细胞酯酶脱乙酰基生成非荧光化合物，随后被 ROS 氧化成荧光 2',7'-二氯荧光素 (DCF)。
产生的荧光信号的强度与细胞内 ROS 水平相关。
从 25 名 NFWoM、25 名 FWM 和 25 名 FWoM 受试者中获得的 500,000 个 PBMC 将使用 CD45、CD3、CD19 和 CD14 抗体进行染色，并与 10 μM 2',7'-二氯荧光素二乙酸酯 (DCFH-DA) 在 37°C 下孵育 30 分钟。
细胞还将用活/死染料标记并通过流式细胞术进行分析。
细胞内 ROS 以 DCF 的中位荧光强度 (MFI) 进行评估，将在总 PBMC、T 和 B 淋巴细胞以及单核细胞中进行评估。
将获取每个群体门中的 40,000 个事件，并使用 Kaluza 软件进行离线分析。
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基线
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患有和不患有多种疾病的体弱个体之间细胞内活性氧 (ROS) 的差异
大体时间：基线
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荧光细胞渗透指示剂 2',7'-二氯荧光素二乙酸酯 (DCFH-DA) 将用于检测细胞内 ROS。
DCFH-DA 被细胞酯酶脱乙酰基生成非荧光化合物，随后被 ROS 氧化成荧光 2',7'-二氯荧光素 (DCF)。
产生的荧光信号的强度与细胞内 ROS 水平相关。
从 25 名 NFWoM、25 名 FWM 和 25 名 FWoM 受试者中获得的 500,000 个 PBMC 将使用 CD45、CD3、CD19 和 CD14 抗体进行染色，并与 10 μM 2',7'-二氯荧光素二乙酸酯 (DCFH-DA) 在 37°C 下孵育 30 分钟。
细胞还将用活/死染料标记并通过流式细胞术进行分析。
细胞内 ROS 以 DCF 的中位荧光强度 (MFI) 进行评估，将在总 PBMC、T 和 B 淋巴细胞以及单核细胞中进行评估。
将获取每个群体门中的 40,000 个事件，并使用 Kaluza 软件进行离线分析。
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基线
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非虚弱个体与无多重病况的虚弱个体之间 PBMC 和 PBMC 亚群代谢组学特征的定性差异
大体时间：基线
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将在任务 2 中描述的 PBMC 以及 T 和 B 淋巴细胞和单核细胞上进行基于非靶向 LC-MS 的代谢组学。细胞样品将使用冷甲醇淬灭。
蛋白质沉淀后，将提取代谢物并通过液相色谱质谱法 (LC-MS) 进行分析。
在使用 Agilent 6546 lc/q-tof 仪器 (Agilent) 进行 MS 检测之前，将使用亲水相互作用色谱 (HILIC) 来解析极性代谢组。整个蛋白质含量将使用 NanoDrop™ (Thermofisher) 进行定量，并用于标准化代谢每个样品的概况。
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基线
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患有和不患有多种疾病的体弱个体之间 PBMC 和 PBMC 亚群代谢组学特征的定性差异
大体时间：基线
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将在任务 2 中描述的 PBMC 以及 T 和 B 淋巴细胞和单核细胞上进行基于非靶向 LC-MS 的代谢组学。细胞样品将使用冷甲醇淬灭。
蛋白质沉淀后，将提取代谢物并通过液相色谱质谱法 (LC-MS) 进行分析。
在使用 Agilent 6546 lc/q-tof 仪器 (Agilent) 进行 MS 检测之前，将使用亲水相互作用色谱 (HILIC) 来解析极性代谢组。整个蛋白质含量将使用 NanoDrop™ (Thermofisher) 进行定量，并用于标准化代谢每个样品的概况。
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基线
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合作者和调查者
调查人员
- 首席研究员：Caterina Trevisan, PhD、Università degli Studi di Ferrara
研究记录日期
研究主要日期
学习开始 (估计的)
初级完成 (估计的)
研究完成 (估计的)
研究注册日期
首次提交
首先提交符合 QC 标准的
首次发布 (实际的)
研究记录更新
最后更新发布 (实际的)
上次提交的符合 QC 标准的更新
最后验证
更多信息
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