Rozregulowanie metabolizmu jako biomarker słabości: rola dysfunkcji mitochondriów (FRAMITO)
Celem tego badania obserwacyjnego jest ocena obecności dysfunkcji mitochondriów związanej ze stresem oksydacyjnym i jej możliwej roli w przypadku zespołu słabości, z wielochorobowością lub bez niej, a także identyfikacja możliwych biomarkerów słabości skorelowanych z dysfunkcją mitochondriów. Główne pytania, na które ma odpowiedzieć, to:
- Jaka jest rola dysfunkcji mitochondriów związanej ze stresem oksydacyjnym w zespole kruchości, biorąc pod uwagę interakcję z wielochorobowością?
- Jakie mogą być specyficzne biomarkery związane z dysfunkcją mitochondriów w ocenie zespołu słabości.
Aby osiągnąć cele badania, zapiszemy trzy kategorie osób starszych:
- Non-Frail bez wielochorobowości (NFWoM);
- Słaby i wielochorobowy (FWM);
- Słaby bez wielochorobowości (FWoM).
Każdy osobnik zostanie poddany ocenie fenotypu zespołu kruchości i wielochorobowości oraz pobraniu próbek krwi w celu wyizolowania komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC). Identyfikacja biomarkerów słabości w każdej grupie uczestników zostanie przeprowadzona poprzez połączenie nieukierunkowanych podejść opartych na metabolomice i badań funkcjonalnych dotyczących konkretnych dysfunkcji mitochondriów przeprowadzonych na PBMC i ich subpopulacjach. Wielowymiarowe techniki statystyczne i techniki uczenia maszynowego pozwolą scharakteryzować trzy grupy fenotypów klinicznych w oparciu o dane molekularne.
Przegląd badań
Status
Szczegółowy opis
Rodzaj badania: obserwacyjne badanie prospektywne. Główny cel: ocena obecności dysfunkcji mitochondriów związanej ze stresem oksydacyjnym i jej możliwej roli w występowaniu zespołu słabości, z wielochorobowością lub bez niej.
Pierwszorzędowy punkt końcowy: dysfunkcja mitochondriów u osób z zespołem słabości. Cele drugorzędne: połączenie nieukierunkowanych podejść opartych na metabolomice i badań funkcjonalnych nad specyficznymi dysfunkcjami mitochondriów przeprowadzonych na PBMC i subpopulacjach PBMC (limfocyty B, limfocyty T i monocyty).
Działalność badawcza zorganizowana jest w następujące zadania:
- Zadanie 1, Rejestracja pacjentów: Do badania będą przyjmowane osoby w wieku 65 lat lub starsze z przychodni lub oddziałów geriatrycznych. Dla każdej osoby przeprowadzimy ocenę zespołu słabości i wielochorobowości oraz pobierzemy próbki krwi w celu wyizolowania komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC). Do badania zostaną włączone trzy kategorie osób: 25 osób zdrowych bez wielochorobowości (NFWoM), 25 osób słabych z wielochorobowością (FWM) i 25 osób słabych bez wielochorobowości (FWoM).
- Zadanie 2, Separacja subpopulacji PBMC: Limfocyty T, limfocyty B i monocyty zostaną oddzielone od zamrożonych PBMC przy użyciu urządzenia do sortowania komórek do sortowania komórek aktywowanego fluorescencją (FACS) i sortownika komórek MoFlo Astrios. Analizy na limfocytach T CD45+/CD3+/CD19-/CD14-, limfocytach B CD45+/CD3-/CD19+/CD14-, monocytach CD45+/CD3-/CD19-/CD14+.
- Zadanie 3, Analiza dysfunkcji mitochondriów w PBMC i subpopulacjach PBMC: Dla każdego osobnika dysfunkcja mitochondriów zostanie oceniona poprzez analizę uszkodzenia mtDNA (za pomocą PCR w czasie rzeczywistym), zmiany masy mitochondriów (za pomocą barwienia Mitotrackerem) oraz wewnątrzkomórkowych i mitochondrialnych reaktywnych form tlenu ( metodą barwienia DCF i MitoSOX). Ponadto będziemy oceniać zmiany w metabolizmie glikolitycznym i mitochondrialnym za pomocą Agilent Seahorse Extra Cellular Flux Analyzer XFe96.
- Zadanie 4, Nieukierunkowana metabolomika PBMC i subpopulacji PBMC: Aby ocenić sygnaturę metaboliczną PBMC i subpopulacji oraz uwypuklić rozregulowania metaboliczne powiązane z zespołem słabości, przeprowadzimy nieukierunkowaną metabolomikę opartą na LC-MS na PBMC, limfocytach T, limfocytach B i monocytach. Analiza polarnego metabolomu pozwoli nam lepiej zrozumieć zmiany metaboliczne związane z rozregulowaniem mitochondriów.
- Zadanie 5, Charakterystyka biomarkerów i molekularnego mechanizmu słabości: Potencjalne biomarkery słabości i mechanizmy molekularne zaangażowane w dysfunkcję mitochondriów będą badane przy użyciu technik statystycznych i uczenia maszynowego na danych molekularnych, metabolicznych i klinicznych. Ten etap pomoże scharakteryzować fenotypy kliniczne na podstawie pomiarów molekularnych.
Typ studiów
Zapisy (Szacowany)
Kontakty i lokalizacje
Kontakt w sprawie studiów
- Nazwa: Caterina Trevisan, PhD
- Numer telefonu: 00393896743650
- E-mail: caterina.trevisan@unife.it
Kryteria uczestnictwa
Kryteria kwalifikacji
Wiek uprawniający do nauki
- Starszy dorosły
Akceptuje zdrowych ochotników
Metoda próbkowania
Badana populacja
Opis
Kryteria przyjęcia:
- Wiek ≥ 65 lat
- Stabilne warunki kliniczne
- Chęć wzięcia udziału w badaniu (wyrażenie świadomej zgody)
- Biegła znajomość języka włoskiego
Kryteria wyłączenia:
- Ostre lub niestabilne stany kliniczne
Plan studiów
Jak projektuje się badanie?
Szczegóły projektu
Kohorty i interwencje
Grupa / Kohorta |
|---|
|
Non-Frail bez wielochorobowości (NFWoM)
Osoby w wieku 65 lat lub starsze, bez zespołu słabości i wielochorobowości.
Grupa ta będzie służyć jako punkt odniesienia dla uczestników, którzy nie są słabi i nie cierpią na wiele chorób przewlekłych.
|
|
Słaby i wielochorobowy (FWM)
Osoby słabe w wieku 65 lat i starsze, cierpiące na wiele chorób.
Do tej grupy należeć będą uczestnicy, którzy wykazują słabości i cierpią na dwie lub więcej chorób przewlekłych.
|
|
Słaby bez wielochorobowości (FWoM)
Osoby słabe w wieku 65 lat lub starsze, bez współwystępowania wielu chorób.
Ta grupa pomoże ocenić kruchość w przypadku braku wielu chorób przewlekłych.
|
Co mierzy badanie?
Podstawowe miary wyniku
Miara wyniku |
Opis środka |
Ramy czasowe |
|---|---|---|
|
Różnica w liczbie kopii mtDNA między osobami słabymi z wieloma chorobami i bez nich
Ramy czasowe: Linia bazowa
|
Kopie mtDNA wyizolowane z całkowitych PBMC oraz z limfocytów T i B oraz monocytów, uzyskane od uczestników za pomocą zestawu JetQuick™ Blood and Cell Culture DNA Midiprep Kit (Invitrogen) oraz 10 ng DNA zostaną użyte do analizy w QuantumStudio 7 Real Time PCR (Biosystemy stosowane). Liczba kopii mtDNA zostanie obliczona poprzez normalizację poziomów mitochondrialnego genu ND1 (mtND1) do poziomów jądrowej mikroglobuliny Beta-2 (B2M). Liczba kopii mtDNA zostanie porównana pomiędzy osobami z zespołem słabości i wielochorobowością a osobami z zespołem słabości bez wielochorobowości. Zespół słabości zostanie wyliczony na podstawie obecności co najmniej trzech kryteriów spośród: mimowolnej utraty masy ciała ≥ 4,5 kg, osłabienia mięśni mierzonego za pomocą uścisku dłoni, zmęczenia zgłaszanego przez pacjenta przez ≥ 3 dni w tygodniu, niskiej aktywności fizycznej (ocenianej za pomocą kwestionariusza IPAQ), i zmniejszoną prędkość chodu (mierzoną w teście marszu na dystansie 4 m). Wielochorobowość będzie definiowana jako obecność co najmniej dwóch chorób przewlekłych. |
Linia bazowa
|
|
Różnica w liczbie kopii mtDNA między osobami zdrowymi i słabymi bez wielochorobowości
Ramy czasowe: Linia bazowa
|
Kopie mtDNA wyizolowane z całkowitych PBMC oraz z limfocytów T i B oraz monocytów, uzyskane od uczestników za pomocą zestawu JetQuick™ Blood and Cell Culture DNA Midiprep Kit (Invitrogen) oraz 10 ng DNA zostaną użyte do analizy w QuantumStudio 7 Real Time PCR (Biosystemy stosowane). Liczba kopii mtDNA zostanie obliczona poprzez normalizację poziomów mitochondrialnego genu ND1 (mtND1) do poziomów jądrowej mikroglobuliny Beta-2 (B2M). Liczba kopii mtDNA zostanie porównana pomiędzy osobami z zespołem słabości i wielochorobowością a osobami z zespołem słabości bez wielochorobowości. Zespół słabości zostanie wyliczony na podstawie obecności co najmniej trzech kryteriów spośród: mimowolnej utraty masy ciała ≥ 4,5 kg, osłabienia mięśni mierzonego za pomocą uścisku dłoni, zmęczenia zgłaszanego przez pacjenta przez ≥ 3 dni w tygodniu, niskiej aktywności fizycznej (ocenianej za pomocą kwestionariusza IPAQ), i zmniejszoną prędkość chodu (mierzoną w teście marszu na dystansie 4 m). Wielochorobowość będzie definiowana jako obecność co najmniej dwóch chorób przewlekłych. |
Linia bazowa
|
Miary wyników drugorzędnych
Miara wyniku |
Opis środka |
Ramy czasowe |
|---|---|---|
|
Różnice w średniej intensywności fluorescencji mitochondriów pomiędzy osobami zdrowymi i słabymi bez wielochorobowości
Ramy czasowe: Linia bazowa
|
500 000 komórek PBMC uzyskanych od uczestników badania zostanie wybarwionych przeciwciałami CD45, CD3, CD19 i CD14 i inkubowanych ze 100 nM Mitotracker Deep Red (Thermo Fisher Scientific) przez 30 minut w temperaturze 30°C.
Komórki będą również znakowane barwnikiem żywym/martwym i analizowane za pomocą cytometrii przepływowej za pomocą sortownika komórek MoFLO Astrios.
Masę mitochondrialną, ocenianą jako mediana intensywności fluorescencji (MFI) Mitotracker Deep Red, ocenia się w całkowitych PBMC, limfocytach T i B oraz monocytach.
Zostaną zebrane 40 000 zdarzeń w każdej bramce populacji, a analiza offline zostanie przeprowadzona za pomocą oprogramowania Kaluza.
|
Linia bazowa
|
|
Różnice w średniej intensywności fluorescencji mitochondriów między osobami słabymi z wielochorobowością i bez niej
Ramy czasowe: Linia bazowa
|
500 000 komórek PBMC uzyskanych od uczestników badania zostanie wybarwionych przeciwciałami CD45, CD3, CD19 i CD14 i inkubowanych ze 100 nM Mitotracker Deep Red (Thermo Fisher Scientific) przez 30 minut w temperaturze 30°C.
Komórki będą również znakowane barwnikiem żywym/martwym i analizowane za pomocą cytometrii przepływowej za pomocą sortownika komórek MoFLO Astrios.
Masę mitochondrialną, ocenianą jako mediana intensywności fluorescencji (MFI) Mitotracker Deep Red, ocenia się w całkowitych PBMC, limfocytach T i B oraz monocytach.
Zostaną zebrane 40 000 zdarzeń w każdej bramce populacji, a analiza offline zostanie przeprowadzona za pomocą oprogramowania Kaluza.
|
Linia bazowa
|
|
Różnica wewnątrzkomórkowych reaktywnych form tlenu (ROS) między osobami zdrowymi i słabymi, bez wielochorobowości
Ramy czasowe: Linia bazowa
|
Do wykrywania wewnątrzkomórkowych ROS zastosowany zostanie fluorescencyjny, przepuszczalny dla komórek wskaźnik, dioctan 2',7'-dichlorofluorescyny (DCFH-DA).
DCFH-DA jest deacetylowany przez esterazy komórkowe do niefluorescencyjnego związku, który jest później utleniany przez ROS do fluorescencyjnej 2',7'-dichlorofluoresceiny (DCF).
Intensywność generowanego sygnału fluorescencyjnego koreluje z wewnątrzkomórkowym poziomem RFT.
500 000 PBMC uzyskanych od 25 osobników NFWoM, 25 FWM i 25 FWoM zostanie wybarwionych przeciwciałami CD45, CD3, CD19 i CD14 i inkubowanych z 10 µM dioctanu 2',7'-dichlorofluorescyny (DCFH-DA) w temperaturze 37°C przez 30 minut .
Komórki będą również znakowane żywym/martwym barwnikiem i analizowane metodą cytometrii przepływowej.
Wewnątrzkomórkowe ROS, oceniane jako mediana intensywności fluorescencji (MFI) DCF, będą oceniane w całkowitych PBMC, limfocytach T i B oraz monocytach.
Zostaną zebrane 40 000 zdarzeń w każdej bramce populacji, a analiza offline zostanie przeprowadzona za pomocą oprogramowania Kaluza.
|
Linia bazowa
|
|
Różnica wewnątrzkomórkowych reaktywnych form tlenu (ROS) między osobami słabymi z wielochorobowością i bez niej
Ramy czasowe: Linia bazowa
|
Do wykrywania wewnątrzkomórkowych ROS zastosowany zostanie fluorescencyjny, przepuszczalny dla komórek wskaźnik, dioctan 2',7'-dichlorofluorescyny (DCFH-DA).
DCFH-DA jest deacetylowany przez esterazy komórkowe do niefluorescencyjnego związku, który jest później utleniany przez ROS do fluorescencyjnej 2',7'-dichlorofluoresceiny (DCF).
Intensywność generowanego sygnału fluorescencyjnego koreluje z wewnątrzkomórkowym poziomem RFT.
500 000 PBMC uzyskanych od 25 osobników NFWoM, 25 FWM i 25 FWoM zostanie wybarwionych przeciwciałami CD45, CD3, CD19 i CD14 i inkubowanych z 10 µM dioctanu 2',7'-dichlorofluorescyny (DCFH-DA) w temperaturze 37°C przez 30 minut .
Komórki będą również znakowane żywym/martwym barwnikiem i analizowane metodą cytometrii przepływowej.
Wewnątrzkomórkowe ROS, oceniane jako mediana intensywności fluorescencji (MFI) DCF, będą oceniane w całkowitych PBMC, limfocytach T i B oraz monocytach.
Zostaną zebrane 40 000 zdarzeń w każdej bramce populacji, a analiza offline zostanie przeprowadzona za pomocą oprogramowania Kaluza.
|
Linia bazowa
|
|
Jakościowa różnica w profilach metabolomicznych PBMC i subpopulacji PBMC między osobami zdrowymi i słabymi bez wielochorobowości
Ramy czasowe: Linia bazowa
|
Nieukierunkowana metabolomika oparta na LC-MS zostanie przeprowadzona na PBMC oraz na limfocytach i monocytach T i B, otrzymanych jak opisano w Zadaniu 2. Próbki komórek zostaną wygaszone zimnym metanolem.
Po wytrąceniu białka metabolity zostaną wyekstrahowane i przeanalizowane metodą spektrometrii mas z chromatografią cieczową (LC-MS).
Chromatografia oddziaływań hydrofilowych (HILIC) zostanie zastosowana w celu rozdzielenia polarnego metabolomu przed wykryciem MS przy użyciu instrumentu Agilent 6546 lc/q-tof (Agilent). Zawartość całego białka zostanie oznaczona ilościowo za pomocą NanoDrop™ (Thermofisher) i wykorzystana do normalizacji metabolizmu profil każdej próbki.
|
Linia bazowa
|
|
Jakościowa różnica w profilach metabolomicznych PBMC i subpopulacji PBMC między osobami słabymi z wieloma chorobami i bez nich
Ramy czasowe: Linia bazowa
|
Nieukierunkowana metabolomika oparta na LC-MS zostanie przeprowadzona na PBMC oraz na limfocytach T i B oraz monocytach, otrzymanych jak opisano w Zadaniu 2. Próbki komórek zostaną wygaszone zimnym metanolem.
Po wytrąceniu białka metabolity zostaną wyekstrahowane i przeanalizowane metodą spektrometrii mas z chromatografią cieczową (LC-MS).
Chromatografia oddziaływań hydrofilowych (HILIC) zostanie zastosowana w celu rozdzielenia polarnego metabolomu przed wykryciem MS przy użyciu instrumentu Agilent 6546 lc/q-tof (Agilent). Zawartość całego białka zostanie oznaczona ilościowo za pomocą NanoDrop™ (Thermofisher) i wykorzystana do normalizacji metabolizmu profil każdej próbki.
|
Linia bazowa
|
Współpracownicy i badacze
Sponsor
Współpracownicy
Śledczy
- Główny śledczy: Caterina Trevisan, PhD, Università degli Studi di Ferrara
Daty zapisu na studia
Główne daty studiów
Rozpoczęcie studiów (Szacowany)
Zakończenie podstawowe (Szacowany)
Ukończenie studiów (Szacowany)
Daty rejestracji na studia
Pierwszy przesłany
Pierwszy przesłany, który spełnia kryteria kontroli jakości
Pierwszy wysłany (Rzeczywisty)
Aktualizacje rekordów badań
Ostatnia wysłana aktualizacja (Rzeczywisty)
Ostatnia przesłana aktualizacja, która spełniała kryteria kontroli jakości
Ostatnia weryfikacja
Więcej informacji
Terminy związane z tym badaniem
Słowa kluczowe
Dodatkowe istotne warunki MeSH
Inne numery identyfikacyjne badania
- 653/2023/Oss/AOUFe
Informacje o lekach i urządzeniach, dokumenty badawcze
Bada produkt leczniczy regulowany przez amerykańską FDA
Bada produkt urządzenia regulowany przez amerykańską FDA
Te informacje zostały pobrane bezpośrednio ze strony internetowej clinicaltrials.gov bez żadnych zmian. Jeśli chcesz zmienić, usunąć lub zaktualizować dane swojego badania, skontaktuj się z register@clinicaltrials.gov. Gdy tylko zmiana zostanie wprowadzona na stronie clinicaltrials.gov, zostanie ona automatycznie zaktualizowana również na naszej stronie internetowej .