Aineenvaihduntahäiriöt heikkouden biomarkkerina: mitokondrioiden toimintahäiriön rooli (FRAMITO)
Tämän havaintotutkimuksen tavoitteena on arvioida oksidatiiviseen stressiin liittyvän mitokondrioiden toimintahäiriön esiintymistä ja sen mahdollista roolia heikkoudessa, multimorbiditeetin kanssa ja ilman, sekä tunnistaa mitokondrioiden toimintahäiriöiden kanssa korreloivat mahdolliset haurauden biomarkkerit. Tärkeimmät kysymykset, joihin se pyrkii vastaamaan, ovat:
- Mikä on oksidatiiviseen stressiin liittyvän mitokondrioiden toimintahäiriön rooli heikkoudessa, kun otetaan huomioon vuorovaikutus multimorbiditeetin kanssa?
- Mitkä voisivat olla mitokondrioiden toimintahäiriöihin liittyvät spesifiset biomarkkerit haurauden arvioinnissa?
Opintotavoitteiden saavuttamiseksi rekisteröimme kolme ikäihmisten luokkaa:
- Non-Frail ilman multimorbiditeettia (NFWoM);
- Frail with Multimorbidity (FWM);
- Frail ilman multimorbiditeettia (FWoM).
Jokaiselle yksilölle tehdään haurauden fenotyypin ja multimorbiditeetin arviointi ja verinäytteiden kerääminen perifeerisen veren mononukleaaristen solujen (PBMC) eristämiseksi. Hauraiden biomarkkerien tunnistaminen kussakin osallistujaryhmässä suoritetaan yhdistämällä kohdistamattomia metabolomiikkaan perustuvia lähestymistapoja ja toiminnallisia tutkimuksia mitokondrioiden erityisistä toimintahäiriöistä, jotka suoritetaan PBMC:illä ja niiden alapopulaatioilla. Monimuuttujat tilastolliset ja koneoppimistekniikat karakterisoivat kolmea kliinistä fenotyyppiryhmää molekyylitietojen perusteella.
Tutkimuksen yleiskatsaus
Tila
Yksityiskohtainen kuvaus
Tutkimustyyppi: havainnollinen prospektiivinen tutkimus. Ensisijainen tavoite: on arvioida oksidatiiviseen stressiin liittyvän mitokondrioiden toimintahäiriön esiintymistä ja sen mahdollista roolia heikkoudessa, multimorbiditeetin kanssa ja ilman.
Ensisijainen päätepiste: mitokondrioiden toimintahäiriö heikkoudessa. Toissijaiset tavoitteet: yhdistää kohdistamattomia metabolomiikkaan perustuvia lähestymistapoja ja toiminnallisia tutkimuksia spesifisten mitokondrioiden toimintahäiriöistä PBMC:illä ja PBMC-alapopulaatioilla (B-lymfosyytit, T-lymfosyytit ja monosyytit).
Tutkimustoiminta on organisoitu seuraaviin tehtäviin:
- Tehtävä 1, Potilasilmoittautuminen: Otamme mukaan 65-vuotiaita tai vanhempia henkilöitä geriatrian poliklinikalta tai geriatrian osastolta. Suoritamme kullekin yksilölle haurauden ja multimorbiditeetin arvioinnin ja keräämme verinäytteitä perifeerisen veren mononukleaaristen solujen (PBMC) eristämiseksi. Mukaan otetaan kolme yksilöluokkaa: 25 ei-hauras yksilöä ilman multimorbiditeettia (NFWoM), 25 heikkoa yksilöä, joilla on multimorbiditeetti (FWM) ja 25 heikkoa yksilöä ilman multimorbiditeettia (FWoM).
- Tehtävä 2, PBMC-alapopulaatioiden erottaminen: T-lymfosyytit, B-lymfosyytit ja monosyytit erotetaan jäädytetyistä PBMC-soluista käyttämällä solulajittelulaitteistoa fluoresenssiaktivoitujen solujen lajittelun (FACS) erottamiseen ja MoFlo Astrios -solulajittelijaa. Analyysit CD45+/CD3+/CD19-/CD14-T-lymfosyyteistä, CD45+/CD3-/CD19+/CD14-B-lymfosyyteistä, CD45+/CD3-/CD19-/CD14+-monosyyteistä.
- Tehtävä 3, PBMC:iden ja PBMC-alapopulaatioiden mitokondrioiden toimintahäiriöiden analyysi: Kullekin yksilölle mitokondrioiden toimintahäiriöt arvioidaan analysoimalla mtDNA-vauriot (reaaliaikaisella PCR:llä), mitokondrioiden massamuutoksia (Mitotracker-värjäyksellä) sekä solunsisäisiä ja mitokondriaalisia spesifisiä reaktiivisia aineita (Oxygenial Species Oxy). DCF- ja MitoSOX-värjäyksellä). Lisäksi arvioimme glykolyyttisen ja mitokondriaalisen aineenvaihdunnan muutoksia käyttämällä Agilent Seahorse Extracellular Flux Analyzer XFe96:ta.
- Tehtävä 4, Kohdistamaton aineenvaihdunta PBMC:issä ja PBMC-alapopulaatioissa: PBMC:iden ja alapopulaatioiden metabolisen allekirjoituksen arvioimiseksi ja haurauteen liittyvien aineenvaihdunnan häiriöiden korostamiseksi suoritamme kohdentamatonta LC-MS-pohjaista metabolomiikkaa PBMC:ille, T-lymfosyyteille, B-lymfosyyteille ja monosyyteille. Polaarisen metabolomin analyysi antaa meille mahdollisuuden ymmärtää paremmin mitokondrioiden säätelyhäiriöihin liittyviä metabolisia muutoksia.
- Tehtävä 5, Biomarkkerien ja heikkouden molekyylimekanismin karakterisointi: Haurauden mahdollisia biomarkkereita ja mitokondrioiden toimintahäiriöihin liittyviä molekyylimekanismeja tutkitaan käyttämällä tilastollisia ja koneoppimistekniikoita molekyyli-, aineenvaihdunta- ja kliinisissä tiedoissa. Tämä vaihe auttaa luonnehtimaan kliinisiä fenotyyppejä molekyylimittausten perusteella.
Opintotyyppi
Ilmoittautuminen (Arvioitu)
Yhteystiedot ja paikat
Opiskeluyhteys
- Nimi: Caterina Trevisan, PhD
- Puhelinnumero: 00393896743650
- Sähköposti: caterina.trevisan@unife.it
Osallistumiskriteerit
Kelpoisuusvaatimukset
Opintokelpoiset iät
- Vanhempi Aikuinen
Hyväksyy terveitä vapaaehtoisia
Näytteenottomenetelmä
Tutkimusväestö
Kuvaus
Sisällyttämiskriteerit:
- Ikä ≥ 65 vuotta
- Vakaat kliiniset tilat
- Halukkuus osallistua tutkimukseen (tietoisen suostumuksen antaminen)
- Italian kielen taito
Poissulkemiskriteerit:
- Akuutit tai epävakaat kliiniset tilat
Opintosuunnitelma
Miten tutkimus on suunniteltu?
Suunnittelun yksityiskohdat
Kohortit ja interventiot
Ryhmä/Kohortti |
|---|
|
Non-Frail ilman multimorbiditeettia (NFWoM)
65-vuotiaat tai sitä vanhemmat henkilöt, joilla ei ole heikkoutta ja monisairautta.
Tämä ryhmä toimii referenssinä osallistujille, jotka eivät ole heikkoja ja joilla ei ole useita kroonisia sairauksia.
|
|
Frail with Multimorbidity (FWM)
Hauraat 65-vuotiaat tai sitä vanhemmat henkilöt, joilla on monisairaus.
Tähän ryhmään kuuluu osallistujia, jotka ovat hauraita ja joilla on kaksi tai useampi krooninen sairaus.
|
|
Frail ilman multimorbiditeettia (FWoM)
Hauraat 65-vuotiaat tai sitä vanhemmat henkilöt, joilla ei ole multimorbiditeettia.
Tämä ryhmä auttaa arvioimaan heikkoutta useiden kroonisten sairauksien puuttuessa.
|
Mitä tutkimuksessa mitataan?
Ensisijaiset tulostoimenpiteet
Tulosmittaus |
Toimenpiteen kuvaus |
Aikaikkuna |
|---|---|---|
|
Ero mtDNA-kopioiden lukumäärässä heikoilla yksilöillä, joilla on multimorbiditeettia vailla ei
Aikaikkuna: Perustaso
|
Kaikkien PBMC-solujen ja T- ja B-lymfosyyteistä ja monosyyteistä eristettyjä mtDNA-kopioita, jotka on saatu osallistujilta JetQuick™ Blood and Cell Culture DNA Midiprep Kit -pakkauksella (Invitrogen), ja 10 ng DNA:ta käytetään analysointiin QuantumStudio 7 Real Time PCR:llä. (Applied Biosystems). mtDNA:n kopiomäärä lasketaan normalisoimalla mitokondrioiden ND1-geenin (mtND1) tasot tuman beeta-2-mikroglobuliinin (B2M) tasoiksi. MtDNA-kopioiden lukumäärää verrataan yksilöiden välillä, joilla on heikko ja monisairaus, verrattuna yksilöihin, joilla on heikkous ilman multimorbiditeettia. Heikkous johdetaan vähintään kolmen kriteerin perusteella: tahaton painonpudotus ≥ 4,5 kg, lihasheikkous mitattuna kädensijalla, itse ilmoittama väsymys ≥ 3 päivänä viikossa, alhainen fyysinen aktiivisuus (arvioitu IPAQ-kyselylomakkeella), ja alentunut kävelynopeus (mitattu 4 metrin kävelytestillä). Multimorbiditeetti määritellään vähintään kahden kroonisen sairauden esiintymiseksi. |
Perustaso
|
|
Ero mtDNA:n kopiomäärässä ei-hauraiden ja heikkojen yksilöiden välillä, joilla ei ole multimorbiditeettia
Aikaikkuna: Perustaso
|
Kaikkien PBMC-solujen ja T- ja B-lymfosyyteistä ja monosyyteistä eristettyjä mtDNA-kopioita, jotka on saatu osallistujilta JetQuick™ Blood and Cell Culture DNA Midiprep Kit -pakkauksella (Invitrogen), ja 10 ng DNA:ta käytetään analysointiin QuantumStudio 7 Real Time PCR:llä. (Applied Biosystems). mtDNA:n kopiomäärä lasketaan normalisoimalla mitokondrioiden ND1-geenin (mtND1) tasot tuman beeta-2-mikroglobuliinin (B2M) tasoiksi. MtDNA-kopioiden lukumäärää verrataan yksilöiden välillä, joilla on heikko ja monisairaus, verrattuna yksilöihin, joilla on heikkous ilman multimorbiditeettia. Heikkous johdetaan vähintään kolmen kriteerin perusteella: tahaton painonpudotus ≥ 4,5 kg, lihasheikkous mitattuna kädensijalla, itse ilmoittama väsymys ≥ 3 päivänä viikossa, alhainen fyysinen aktiivisuus (arvioitu IPAQ-kyselylomakkeella), ja alentunut kävelynopeus (mitattu 4 metrin kävelytestillä). Multimorbiditeetti määritellään vähintään kahden kroonisen sairauden esiintymiseksi. |
Perustaso
|
Toissijaiset tulostoimenpiteet
Tulosmittaus |
Toimenpiteen kuvaus |
Aikaikkuna |
|---|---|---|
|
Mitokondrioiden fluoresenssin keskimääräisen intensiteetin vaihtelu ei-hauraiden ja heikkojen yksilöiden välillä, joilla ei ole multimorbiditeettia
Aikaikkuna: Perustaso
|
500 000 tutkimuksen osallistujilta saatua PBMC:tä värjätään CD45-, CD3-, CD19- ja CD14-vasta-aineilla ja inkuboidaan 100 nM Mitotracker Deep Red (Thermo Fisher Scientific) kanssa 30 minuuttia 30 °C:ssa.
Solut leimataan myös Live/Dead-väriaineella ja analysoidaan virtaussytometrialla MoFLO Astrios -solulajittelijalla.
Mitokondrioiden massa, joka mitataan Mitotracker Deep Redin mediaanifluoresenssin intensiteetillä (MFI), arvioidaan PBMC:iden, T- ja B-lymfosyyttien ja monosyyttien kokonaismääränä.
Jokaisessa väestöportissa hankitaan 40 000 tapahtumaa ja offline-analyysi suoritetaan Kaluza-ohjelmistolla.
|
Perustaso
|
|
Mitokondrioiden fluoresenssin keskimääräisen intensiteetin vaihtelu heikkojen yksilöiden välillä, joilla on multimorbiditeettia ja ilman
Aikaikkuna: Perustaso
|
500 000 tutkimuksen osallistujilta saatua PBMC:tä värjätään CD45-, CD3-, CD19- ja CD14-vasta-aineilla ja inkuboidaan 100 nM Mitotracker Deep Red (Thermo Fisher Scientific) kanssa 30 minuuttia 30 °C:ssa.
Solut leimataan myös Live/Dead-väriaineella ja analysoidaan virtaussytometrialla MoFLO Astrios -solulajittelijalla.
Mitokondrioiden massa, joka mitataan Mitotracker Deep Redin mediaanifluoresenssin intensiteetillä (MFI), arvioidaan PBMC:iden, T- ja B-lymfosyyttien ja monosyyttien kokonaismääränä.
Jokaisessa väestöportissa hankitaan 40 000 tapahtumaa ja offline-analyysi suoritetaan Kaluza-ohjelmistolla.
|
Perustaso
|
|
Solunsisäisten reaktiivisten happilajien (ROS) ero ei-hauraiden ja heikkojen yksilöiden välillä, joilla ei ole multimorbiditeettia
Aikaikkuna: Perustaso
|
Fluoresoivaa solua läpäisevää indikaattoria 2',7'-dikloorifluoresiinidiasetaattia (DCFH-DA) käytetään solunsisäisen ROS:n havaitsemiseen.
DCFH-DA deasetyloidaan soluesteraasien toimesta ei-fluoresoivaksi yhdisteeksi, joka myöhemmin hapetetaan ROS:n vaikutuksesta fluoresoivaksi 2',7'-dikloorifluoreseiiniksi (DCF).
Muodostetun fluoresoivan signaalin intensiteetti korreloi ROS:n solunsisäisen tason kanssa.
500 000 PBMC:tä, jotka on saatu 25 NFWoM-, 25 FWM- ja 25 FWoM-potilaalta, värjätään CD45-, CD3-, CD19- ja CD14-vasta-aineilla ja inkuboidaan 10 μM 2',7'-dikloorifluoresiinidiasetaatin kanssa 30 minuuttia (DCF3H-7°C) .
Solut myös leimataan Live/Dead-väriaineella ja analysoidaan virtaussytometrialla.
Solunsisäinen ROS, joka arvioidaan DCF:n mediaanifluoresenssin intensiteetiksi (MFI), arvioidaan PBMC:iden, T- ja B-lymfosyyttien ja monosyyttien kokonaismäärässä.
Jokaisessa väestöportissa hankitaan 40 000 tapahtumaa ja offline-analyysi suoritetaan Kaluza-ohjelmistolla.
|
Perustaso
|
|
Erot solunsisäisten reaktiivisten happilajien (ROS) välillä monisairautta sairastavien ja heikentävien yksilöiden välillä
Aikaikkuna: Perustaso
|
Fluoresoivaa solua läpäisevää indikaattoria 2',7'-dikloorifluoresiinidiasetaattia (DCFH-DA) käytetään solunsisäisen ROS:n havaitsemiseen.
DCFH-DA deasetyloidaan soluesteraasien toimesta ei-fluoresoivaksi yhdisteeksi, joka myöhemmin hapetetaan ROS:n vaikutuksesta fluoresoivaksi 2',7'-dikloorifluoreseiiniksi (DCF).
Muodostetun fluoresoivan signaalin intensiteetti korreloi ROS:n solunsisäisen tason kanssa.
500 000 PBMC:tä, jotka on saatu 25 NFWoM-, 25 FWM- ja 25 FWoM-potilaalta, värjätään CD45-, CD3-, CD19- ja CD14-vasta-aineilla ja inkuboidaan 10 μM 2',7'-dikloorifluoresiinidiasetaatin kanssa 30 minuuttia (DCF3H-7°C) .
Solut myös leimataan Live/Dead-väriaineella ja analysoidaan virtaussytometrialla.
Solunsisäinen ROS, joka arvioidaan DCF:n mediaanifluoresenssin intensiteetiksi (MFI), arvioidaan PBMC:iden, T- ja B-lymfosyyttien ja monosyyttien kokonaismäärässä.
Jokaisessa väestöportissa hankitaan 40 000 tapahtumaa ja offline-analyysi suoritetaan Kaluza-ohjelmistolla.
|
Perustaso
|
|
Kvalitatiiviset erot PBMC- ja PBMC-alapopulaatioiden metabolomiikkaprofiileissa ei-hauraiden ja heikkojen yksilöiden välillä, joilla ei ole multimorbiditeettia
Aikaikkuna: Perustaso
|
Kohdistamaton LC-MS-pohjainen metabolomiikka suoritetaan PBMC:ille ja T- ja B-lymfosyyteille ja monosyyteille, jotka on saatu tehtävässä 2 kuvatulla tavalla. Solunäytteet sammutetaan käyttämällä kylmää metanolia.
Proteiinisaostuksen jälkeen metaboliitit uutetaan ja analysoidaan nestekromatografisella massaspektrometrialla (LC-MS).
Hydrofiilistä vuorovaikutuskromatografiaa (HILIC) käytetään polaarisen metabolomin erottamiseen ennen MS-detektiota käyttämällä Agilent 6546 lc/q-tof -laitetta (Agilent). Koko proteiinipitoisuus kvantifioidaan NanoDrop™:lla (Thermofisher) ja sitä käytetään aineenvaihdunnan normalisoimiseen. kunkin näytteen profiili.
|
Perustaso
|
|
Kvalitatiiviset erot PBMC- ja PBMC-alapopulaatioiden metabolomiikkaprofiileissa monisairautta sairastavien ja ilman multimorbiditeettia sairastavien yksilöiden välillä
Aikaikkuna: Perustaso
|
Kohdistamaton LC-MS-pohjainen metabolomiikka suoritetaan PBMC:ille ja T- ja B-lymfosyyteille ja monosyyteille, jotka on saatu tehtävässä 2 kuvatulla tavalla. Solunäytteet sammutetaan käyttämällä kylmää metanolia.
Proteiinisaostuksen jälkeen metaboliitit uutetaan ja analysoidaan nestekromatografisella massaspektrometrialla (LC-MS).
Hydrofiilistä vuorovaikutuskromatografiaa (HILIC) käytetään polaarisen metabolomin erottamiseen ennen MS-detektiota käyttämällä Agilent 6546 lc/q-tof -laitetta (Agilent). Koko proteiinipitoisuus kvantifioidaan NanoDrop™:lla (Thermofisher) ja sitä käytetään aineenvaihdunnan normalisoimiseen. kunkin näytteen profiili.
|
Perustaso
|
Yhteistyökumppanit ja tutkijat
Sponsori
Yhteistyökumppanit
Tutkijat
- Päätutkija: Caterina Trevisan, PhD, Università degli Studi di Ferrara
Opintojen ennätyspäivät
Opi tärkeimmät päivämäärät
Opiskelun aloitus (Arvioitu)
Ensisijainen valmistuminen (Arvioitu)
Opintojen valmistuminen (Arvioitu)
Opintoihin ilmoittautumispäivät
Ensimmäinen lähetetty
Ensimmäinen toimitettu, joka täytti QC-kriteerit
Ensimmäinen Lähetetty (Todellinen)
Tutkimustietojen päivitykset
Viimeisin päivitys julkaistu (Todellinen)
Viimeisin lähetetty päivitys, joka täytti QC-kriteerit
Viimeksi vahvistettu
Lisää tietoa
Tähän tutkimukseen liittyvät termit
Avainsanat
Muita asiaankuuluvia MeSH-ehtoja
Muut tutkimustunnusnumerot
- 653/2023/Oss/AOUFe
Lääke- ja laitetiedot, tutkimusasiakirjat
Tutkii yhdysvaltalaista FDA sääntelemää lääkevalmistetta
Tutkii yhdysvaltalaista FDA sääntelemää laitetuotetta
Nämä tiedot haettiin suoraan verkkosivustolta clinicaltrials.gov ilman muutoksia. Jos sinulla on pyyntöjä muuttaa, poistaa tai päivittää tutkimustietojasi, ota yhteyttä register@clinicaltrials.gov. Heti kun muutos on otettu käyttöön osoitteessa clinicaltrials.gov, se päivitetään automaattisesti myös verkkosivustollemme .