Метаболическая дисрегуляция как биомаркер слабости: роль митохондриальной дисфункции (FRAMITO)
Цель этого наблюдательного исследования — оценить наличие митохондриальной дисфункции, связанной с окислительным стрессом, и ее возможную роль в слабости с мультиморбидностью и без нее, а также идентифицировать возможные биомаркеры слабости, коррелирующие с митохондриальной дисфункцией. Основные вопросы, на которые он призван ответить:
- Какова роль митохондриальной дисфункции, связанной с окислительным стрессом, при слабости с учетом взаимодействия с мультиморбидностью?
- Каковы могут быть конкретные биомаркеры, связанные с митохондриальной дисфункцией при оценке слабости?
Для достижения целей исследования мы наберем три категории пожилых людей:
- Нехрупкость без мультиморбидности (NFWoM);
- Хрупкость с мультиморбидностью (FWM);
- Хрупкость без мультиморбидности (FWoM).
Каждый человек пройдет оценку фенотипа слабости и мультиморбидности, а также сбор образцов крови для выделения мононуклеарных клеток периферической крови (МКПК). Идентификация биомаркеров слабости в каждой группе участников будет осуществляться путем объединения нецелевых подходов, основанных на метаболомике, и функциональных исследований конкретных митохондриальных дисфункций, выполненных на РВМС и их субпопуляциях. Методы многомерной статистики и машинного обучения будут характеризовать три группы клинических фенотипов на основе молекулярных данных.
Обзор исследования
Статус
Подробное описание
Тип исследования: обсервационное проспективное исследование. Основная цель: оценить наличие митохондриальной дисфункции, связанной с окислительным стрессом, и ее возможную роль в слабости с мультиморбидностью и без нее.
Первичная конечная точка: митохондриальная дисфункция при слабости. Вторичные цели: объединить нецелевые подходы, основанные на метаболомике, и функциональные исследования специфических митохондриальных дисфункций, выполненные на РВМС и субпопуляциях РВМС (В-лимфоциты, Т-лимфоциты и моноциты).
Научно-исследовательская деятельность организуется по следующим задачам:
- Задача 1. Набор пациентов. Мы будем набирать людей в возрасте 65 лет и старше из гериатрических амбулаторных клиник или гериатрических отделений. Для каждого человека мы проведем оценку слабости и мультиморбидности, а также соберем образцы крови для выделения мононуклеарных клеток периферической крови (МКПК). Будут включены три категории лиц: 25 здоровых людей без мультиморбидности (NFWoM), 25 слабых людей с мультиморбидностью (FWM) и 25 слабых людей без мультиморбидности (FWoM).
- Задача 2. Разделение субпопуляций РВМС: Т-лимфоциты, В-лимфоциты и моноциты будут отделены от замороженных РВМС с использованием установки для сортировки клеток, активируемой флуоресценцией (FACS), и сортировщика клеток MoFlo Astrios. Анализы на CD45+/CD3+/CD19-/CD14- Т-лимфоциты, CD45+/CD3-/CD19+/CD14- B-лимфоциты, CD45+/CD3-/CD19-/CD14+ моноциты.
- Задача 3. Анализ митохондриальной дисфункции на РВМС и субпопуляциях РВМС. Для каждого человека митохондриальная дисфункция будет оцениваться путем анализа повреждения мтДНК (методом ПЦР в реальном времени), изменения массы митохондрий (путем окрашивания митотрекером), а также внутриклеточных и митохондриальных активных форм кислорода ( методом окрашивания DCF и MitoSOX). Кроме того, мы будем оценивать изменение гликолитического и митохондриального метаболизма с помощью анализатора внеклеточного потока Agilent Seahorse XFe96.
- Задача 4. Нецелевая метаболомика РВМС и субпопуляций РВМС. Чтобы оценить метаболические характеристики РВМС и субпопуляций и выделить метаболические нарушения регуляции, связанные со слабостью, мы проведем нецелевую метаболомику на основе LC-MS на РВМС, Т-лимфоцитах, В-лимфоцитах и моноцитах. Анализ полярного метаболома позволит нам лучше понять метаболические изменения, связанные с митохондриальной дисрегуляцией.
- Задача 5. Характеристика биомаркеров и молекулярного механизма слабости. Потенциальные биомаркеры слабости и молекулярные механизмы, участвующие в митохондриальной дисфункции, будут изучены с использованием статистических методов и методов машинного обучения на молекулярных, метаболических и клинических данных. Этот шаг поможет охарактеризовать клинические фенотипы на основе молекулярных измерений.
Тип исследования
Регистрация (Оцененный)
Контакты и местонахождение
Контакты исследования
- Имя: Caterina Trevisan, PhD
- Номер телефона: 00393896743650
- Электронная почта: caterina.trevisan@unife.it
Критерии участия
Критерии приемлемости
Возраст, подходящий для обучения
- Пожилой взрослый
Принимает здоровых добровольцев
Метод выборки
Исследуемая популяция
Описание
Критерии включения:
- Возраст ≥ 65 лет
- Стабильные клинические состояния
- Готовность участвовать в исследовании (предоставление информированного согласия)
- Владение итальянским языком
Критерий исключения:
- Острые или нестабильные клинические состояния
Учебный план
Как устроено исследование?
Детали дизайна
Когорты и вмешательства
Группа / когорта |
|---|
|
Нехрупкость без мультиморбидности (NFWoM)
Лица в возрасте 65 лет и старше без слабости и мультиморбидности.
Эта группа будет служить ориентиром для участников, которые не слабы и не страдают множественными хроническими заболеваниями.
|
|
Хрупкость с мультиморбидностью (FWM)
Ослабленные люди в возрасте 65 лет и старше с мультиморбидностью.
В эту группу войдут участники, которые проявляют слабость и имеют два или более хронических заболевания.
|
|
Хрупкость без мультиморбидности (FWoM)
Ослабленные люди в возрасте 65 лет и старше без мультиморбидности.
Эта группа поможет оценить слабость при отсутствии множественных хронических заболеваний.
|
Что измеряет исследование?
Первичные показатели результатов
Мера результата |
Мера Описание |
Временное ограничение |
|---|---|---|
|
Разница в количестве копий мтДНК между ослабленными людьми с мультиморбидностью и без нее
Временное ограничение: Базовый уровень
|
Копии мтДНК, выделенные из общего числа РВМС, а также из Т- и В-лимфоцитов и моноцитов, полученных от участников с помощью набора JetQuick™ Blood and Cell Culture DNA Midiprep Kit (Invitrogen), и 10 нг ДНК будут использоваться для анализа с помощью QuantumStudio 7 ПЦР в реальном времени. (Прикладные биосистемы). Число копий мтДНК будет рассчитываться путем нормализации уровней митохондриального гена ND1 (mtND1) к уровням ядерного бета-2-микроглобулина (B2M). Количество копий мтДНК будет сравниваться между людьми со слабостью и мультиморбидностью и людьми со слабостью без мультиморбидности. Слабость будет определяться на основании наличия как минимум трех критериев, среди которых: непроизвольная потеря веса ≥ 4,5 кг, мышечная слабость, измеряемая по ручному захвату, самооценка утомляемости ≥ 3 дней в неделю, низкая физическая активность (оценивается с помощью опросника IPAQ), и снижение скорости ходьбы (измеряется с помощью теста ходьбы на 4 метра). Мультиморбидность будет определяться как наличие как минимум двух хронических заболеваний. |
Базовый уровень
|
|
Разница в количестве копий мтДНК между здоровыми и слабыми людьми без мультиморбидности
Временное ограничение: Базовый уровень
|
Копии мтДНК, выделенные из общего числа РВМС, а также из Т- и В-лимфоцитов и моноцитов, полученных от участников с помощью набора JetQuick™ Blood and Cell Culture DNA Midiprep Kit (Invitrogen), и 10 нг ДНК будут использоваться для анализа с помощью QuantumStudio 7 ПЦР в реальном времени. (Прикладные биосистемы). Число копий мтДНК будет рассчитываться путем нормализации уровней митохондриального гена ND1 (mtND1) к уровням ядерного бета-2-микроглобулина (B2M). Количество копий мтДНК будет сравниваться между людьми со слабостью и мультиморбидностью и людьми со слабостью без мультиморбидности. Слабость будет определяться на основании наличия как минимум трех критериев, среди которых: непроизвольная потеря веса ≥ 4,5 кг, мышечная слабость, измеряемая по ручному захвату, самооценка утомляемости ≥ 3 дней в неделю, низкая физическая активность (оценивается с помощью опросника IPAQ), и снижение скорости ходьбы (измеряется с помощью теста ходьбы на 4 метра). Мультиморбидность будет определяться как наличие как минимум двух хронических заболеваний. |
Базовый уровень
|
Вторичные показатели результатов
Мера результата |
Мера Описание |
Временное ограничение |
|---|---|---|
|
Вариации средней интенсивности флуоресценции митохондрий у здоровых и слабых людей без мультиморбидности
Временное ограничение: Базовый уровень
|
500 000 РВМС, полученных от участников исследования, будут окрашены антителами CD45, CD3, CD19 и CD14 и инкубированы с 100 нМ Mitotracker Deep Red (Thermo Fisher Scientific) в течение 30 минут при 30°C.
Клетки также будут помечены живым/мертвым красителем и проанализированы методом проточной цитометрии с помощью сортировщика клеток MoFLO Astrios.
Митохондриальную массу, оцениваемую как медианную интенсивность флуоресценции (MFI) Mitotracker Deep Red, будут оценивать по общему количеству РВМС, Т- и В-лимфоцитов и моноцитов.
Будет собрано 40 000 событий в каждом элементе популяции, и автономный анализ будет выполнен с помощью программного обеспечения Kaluza.
|
Базовый уровень
|
|
Вариации средней интенсивности флуоресценции митохондрий между ослабленными людьми с мультиморбидностью и без нее
Временное ограничение: Базовый уровень
|
500 000 РВМС, полученных от участников исследования, будут окрашены антителами CD45, CD3, CD19 и CD14 и инкубированы с 100 нМ Mitotracker Deep Red (Thermo Fisher Scientific) в течение 30 минут при 30°C.
Клетки также будут помечены живым/мертвым красителем и проанализированы методом проточной цитометрии с помощью сортировщика клеток MoFLO Astrios.
Митохондриальную массу, оцениваемую как медианную интенсивность флуоресценции (MFI) Mitotracker Deep Red, будут оценивать по общему количеству РВМС, Т- и В-лимфоцитов и моноцитов.
Будет собрано 40 000 событий в каждом элементе популяции, и автономный анализ будет выполнен с помощью программного обеспечения Kaluza.
|
Базовый уровень
|
|
Разница во внутриклеточных активных формах кислорода (АФК) у здоровых и слабых людей без мультиморбидности
Временное ограничение: Базовый уровень
|
Для обнаружения внутриклеточных АФК будет использоваться флуоресцентный проницаемый для клеток индикатор 2',7'-дихлорфлуоресциндиацетат (DCFH-DA).
DCFH-DA деацетилируется клеточными эстеразами до нефлуоресцентного соединения, которое позже окисляется АФК во флуоресцентный 2',7'-дихлорфлуоресцеин (DCF).
Интенсивность генерируемого флуоресцентного сигнала коррелирует с внутриклеточным уровнем АФК.
500 000 РВМС, полученных от 25 субъектов NFWoM, 25 FWM и 25 FWoM, будут окрашены антителами CD45, CD3, CD19 и CD14 и инкубированы с 10 мкМ 2',7'-дихлорфлуоресциндиацетата (DCFH-DA) при 37°C в течение 30 минут. .
Клетки также будут помечены живым/мертвым красителем и проанализированы с помощью проточной цитометрии.
Внутриклеточные АФК, оцениваемые как медианная интенсивность флуоресценции (MFI) DCF, будут оцениваться в общем количестве РВМС, Т- и В-лимфоцитов и моноцитов.
Будет собрано 40 000 событий в каждом элементе популяции, и автономный анализ будет выполнен с помощью программного обеспечения Kaluza.
|
Базовый уровень
|
|
Разница во внутриклеточных активных формах кислорода (АФК) у ослабленных людей с мультиморбидностью и без нее
Временное ограничение: Базовый уровень
|
Для обнаружения внутриклеточных АФК будет использоваться флуоресцентный проницаемый для клеток индикатор 2',7'-дихлорфлуоресциндиацетат (DCFH-DA).
DCFH-DA деацетилируется клеточными эстеразами до нефлуоресцентного соединения, которое позже окисляется АФК во флуоресцентный 2',7'-дихлорфлуоресцеин (DCF).
Интенсивность генерируемого флуоресцентного сигнала коррелирует с внутриклеточным уровнем АФК.
500 000 РВМС, полученных от 25 субъектов NFWoM, 25 FWM и 25 FWoM, будут окрашены антителами CD45, CD3, CD19 и CD14 и инкубированы с 10 мкМ 2',7'-дихлорфлуоресциндиацетата (DCFH-DA) при 37°C в течение 30 минут. .
Клетки также будут помечены живым/мертвым красителем и проанализированы с помощью проточной цитометрии.
Внутриклеточные АФК, оцениваемые как медианная интенсивность флуоресценции (MFI) DCF, будут оцениваться в общем количестве РВМС, Т- и В-лимфоцитов и моноцитов.
Будет собрано 40 000 событий в каждом элементе популяции, и автономный анализ будет выполнен с помощью программного обеспечения Kaluza.
|
Базовый уровень
|
|
Качественная разница в метаболомических профилях PBMC и субпопуляций PBMC между здоровыми и слабыми людьми без мультиморбидности
Временное ограничение: Базовый уровень
|
Нецелевой метаболомный анализ на основе ЖХ-МС будет проводиться на РВМС, а также на Т- и В-лимфоцитах и моноцитах, полученных, как описано в задаче 2. Образцы клеток будут гаситься с использованием холодного метанола.
После осаждения белка метаболиты будут экстрагированы и проанализированы с помощью жидкостной хроматографии и масс-спектрометрии (ЖХ-МС).
Хроматография гидрофильного взаимодействия (HILIC) будет использоваться для определения полярного метаболома перед МС-обнаружением с использованием прибора Agilent 6546 lc/q-tof (Agilent). Содержание всего белка будет количественно определяться с помощью NanoDrop™ (Thermofisher) и использоваться для нормализации метаболического процесса. профиль каждого образца.
|
Базовый уровень
|
|
Качественная разница в метаболомных профилях PBMC и субпопуляций PBMC между ослабленными людьми с мультиморбидностью и без нее
Временное ограничение: Базовый уровень
|
Нецелевой метаболомный анализ на основе ЖХ-МС будет проводиться на РВМС, а также на Т- и В-лимфоцитах и моноцитах, полученных, как описано в задаче 2. Образцы клеток будут гаситься с использованием холодного метанола.
После осаждения белка метаболиты будут экстрагированы и проанализированы с помощью жидкостной хроматографии и масс-спектрометрии (ЖХ-МС).
Хроматография гидрофильного взаимодействия (HILIC) будет использоваться для определения полярного метаболома перед МС-обнаружением с использованием прибора Agilent 6546 lc/q-tof (Agilent). Содержание всего белка будет количественно определяться с помощью NanoDrop™ (Thermofisher) и использоваться для нормализации метаболического процесса. профиль каждого образца.
|
Базовый уровень
|
Соавторы и исследователи
Спонсор
Соавторы
Следователи
- Главный следователь: Caterina Trevisan, PhD, Università degli Studi di Ferrara
Даты записи исследования
Изучение основных дат
Начало исследования (Оцененный)
Первичное завершение (Оцененный)
Завершение исследования (Оцененный)
Даты регистрации исследования
Первый отправленный
Впервые представлено, что соответствует критериям контроля качества
Первый опубликованный (Действительный)
Обновления учебных записей
Последнее опубликованное обновление (Действительный)
Последнее отправленное обновление, отвечающее критериям контроля качества
Последняя проверка
Дополнительная информация
Термины, связанные с этим исследованием
Ключевые слова
Дополнительные соответствующие термины MeSH
Другие идентификационные номера исследования
- 653/2023/Oss/AOUFe
Информация о лекарствах и устройствах, исследовательские документы
Изучает лекарственный продукт, регулируемый FDA США.
Изучает продукт устройства, регулируемый Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США.
Эта информация была получена непосредственно с веб-сайта clinicaltrials.gov без каких-либо изменений. Если у вас есть запросы на изменение, удаление или обновление сведений об исследовании, обращайтесь по адресу register@clinicaltrials.gov. Как только изменение будет реализовано на clinicaltrials.gov, оно будет автоматически обновлено и на нашем веб-сайте. .