Desregulación metabólica como biomarcador de fragilidad: papel de la disfunción mitocondrial (FRAMITO)
El objetivo de este estudio observacional es evaluar la presencia de disfunción mitocondrial relacionada con el estrés oxidativo y su posible papel en la fragilidad, con y sin multimorbilidad, e identificar posibles biomarcadores de fragilidad correlacionados con la disfunción mitocondrial. Las principales preguntas que pretende responder son:
- ¿Cuál es el papel de la disfunción mitocondrial relacionada con el estrés oxidativo en la fragilidad, teniendo en cuenta la interacción con la multimorbilidad?
- Cuáles podrían ser los biomarcadores específicos asociados a la disfunción mitocondrial en la evaluación de la fragilidad.
Para alcanzar los objetivos del estudio, inscribiremos tres categorías de adultos mayores:
- No Frágiles sin Multimorbilidad (NFWoM);
- Frágil con Multimorbilidad (FWM);
- Frágil sin Multimorbilidad (FWoM).
Cada individuo se someterá a una evaluación del fenotipo de fragilidad y multimorbilidad, y a la recolección de muestras de sangre para aislar células mononucleares de sangre periférica (PBMC). La identificación de biomarcadores de fragilidad en cada grupo de participantes se realizará combinando enfoques basados en la metabolómica no dirigida y estudios funcionales sobre disfunciones mitocondriales específicas realizadas en PBMC y sus subpoblaciones. Las técnicas estadísticas multivariadas y de aprendizaje automático caracterizarán los tres grupos de fenotipos clínicos basándose en datos moleculares.
Descripción general del estudio
Estado
Descripción detallada
Tipo de estudio: estudio prospectivo observacional. Objetivo principal: es evaluar la presencia de disfunción mitocondrial relacionada con el estrés oxidativo y su posible papel en la fragilidad, con y sin multimorbilidad.
Criterio de valoración principal: disfunción mitocondrial en la fragilidad. Objetivos secundarios: combinar enfoques basados en metabolómica no dirigida y estudios funcionales sobre disfunciones mitocondriales específicas realizadas en PBMC y subpoblaciones de PBMC (linfocitos B, linfocitos T y monocitos).
Las actividades de investigación se organizan en las siguientes tareas:
- Tarea 1, Inscripción de pacientes: inscribiremos a personas de 65 años o más de clínicas ambulatorias geriátricas o salas geriátricas. Para cada individuo, realizaremos una evaluación de fragilidad y multimorbilidad, y recolectaremos muestras de sangre para aislar Células mononucleares de sangre periférica (PBMC). Se inscribirán tres categorías de personas: 25 personas no frágiles sin multimorbilidad (NFWoM), 25 personas frágiles con multimorbilidad (FWM) y 25 personas frágiles sin multimorbilidad (FWoM).
- Tarea 2, Separación de subpoblaciones de PBMC: los linfocitos T, los linfocitos B y los monocitos se separarán de las PBMC congeladas utilizando la instalación de clasificación de células para la separación de clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) y el clasificador de células MoFlo Astrios. Los análisis se realizaron en linfocitos T CD45+/CD3+/CD19-/CD14-, linfocitos B CD45+/CD3-/CD19+/CD14-, monocitos CD45+/CD3-/CD19-/CD14+.
- Tarea 3, Análisis de disfunción mitocondrial en PBMC y subpoblaciones de PBMC: para cada individuo, la disfunción mitocondrial se evaluará analizando el daño del ADNmt (mediante PCR en tiempo real), la alteración de la masa mitocondrial (mediante tinción con Mitotracker) y las especies reactivas de oxígeno intracelulares y mitocondriales ( mediante tinción con DCF y MitoSOX). Además, evaluaremos la alteración del metabolismo glucolítico y mitocondrial utilizando el analizador de flujo extracelular Agilent Seahorse XFe96.
- Tarea 4, Metabolómica no dirigida en PBMC y subpoblaciones de PBMC: para evaluar la firma metabólica de PBMC y subpoblaciones y resaltar las desregulaciones metabólicas relacionadas con la fragilidad, realizaremos metabolómica basada en LC-MS no dirigida en PBMC, linfocitos T, linfocitos B y monocitos. El análisis del metaboloma polar nos permitirá comprender mejor las alteraciones metabólicas asociadas a la desregulación mitocondrial.
- Tarea 5, Caracterización de biomarcadores y mecanismos moleculares de fragilidad: Los posibles biomarcadores de fragilidad y los mecanismos moleculares implicados en la disfunción mitocondrial se estudiarán utilizando técnicas estadísticas y de aprendizaje automático sobre datos moleculares, metabólicos y clínicos. Este paso ayudará a caracterizar fenotipos clínicos basados en mediciones moleculares.
Tipo de estudio
Inscripción (Estimado)
Contactos y Ubicaciones
Estudio Contacto
- Nombre: Caterina Trevisan, PhD
- Número de teléfono: 00393896743650
- Correo electrónico: caterina.trevisan@unife.it
Criterios de participación
Criterio de elegibilidad
Edades elegibles para estudiar
- Adulto Mayor
Acepta Voluntarios Saludables
Método de muestreo
Población de estudio
Descripción
Criterios de inclusión:
- Edad ≥ 65 años
- Condiciones clínicas estables.
- Voluntad de participar en el estudio (provisión de consentimiento informado)
- Dominio del idioma italiano.
Criterio de exclusión:
- Condiciones clínicas agudas o inestables.
Plan de estudios
¿Cómo está diseñado el estudio?
Detalles de diseño
Cohortes e Intervenciones
Grupo / Cohorte |
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No frágiles sin multimorbilidad (NFWoM)
Individuos de 65 años o más sin fragilidad y sin multimorbilidad.
Este grupo servirá como referencia para los participantes que no sean frágiles y no tengan múltiples enfermedades crónicas.
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Frágil con multimorbilidad (FWM)
Individuos frágiles de 65 años o más que presentan multimorbilidad.
Este grupo incluirá participantes que muestren fragilidad y tengan dos o más enfermedades crónicas.
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Frágil sin multimorbilidad (FWoM)
Individuos frágiles de 65 años o más sin multimorbilidad.
Este grupo ayudará a evaluar la fragilidad en ausencia de múltiples afecciones crónicas.
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¿Qué mide el estudio?
Medidas de resultado primarias
Medida de resultado |
Medida Descripción |
Periodo de tiempo |
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Diferencia en el número de copias de ADNmt entre individuos frágiles con y sin multimorbilidad
Periodo de tiempo: Base
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Se utilizarán copias de ADNmt aisladas de PBMC totales y de linfocitos y monocitos T y B, obtenidas de los participantes, con el kit JetQuick™ Blood and Cell Culture DNA Midiprep (Invitrogen) y 10 ng de ADN para el análisis en QuantumStudio 7 Real Time PCR. (Biosistemas Aplicados). El número de copias de ADNmt se calculará normalizando los niveles del gen ND1 mitocondrial (mtND1) a los niveles de microglobulina beta-2 nuclear (B2M). Se comparará el número de copias de ADNmt entre individuos con fragilidad y multimorbilidad versus individuos con fragilidad sin multimorbilidad. La fragilidad se derivará en función de la presencia de al menos tres criterios entre: pérdida de peso involuntaria ≥ 4,5 kg, debilidad muscular medida mediante agarre manual, fatiga autoinformada ≥ 3 días por semana, baja actividad física (evaluada con el cuestionario IPAQ), y velocidad de marcha reducida (medida mediante la prueba de marcha de 4 m). La multimorbilidad se definirá como la presencia de al menos dos enfermedades crónicas. |
Base
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Diferencia en el número de copias de ADNmt entre individuos no frágiles y frágiles sin multimorbilidad
Periodo de tiempo: Base
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Se utilizarán copias de ADNmt aisladas de PBMC totales y de linfocitos y monocitos T y B, obtenidas de los participantes, con el kit JetQuick™ Blood and Cell Culture DNA Midiprep (Invitrogen) y 10 ng de ADN para el análisis en QuantumStudio 7 Real Time PCR. (Biosistemas Aplicados). El número de copias de ADNmt se calculará normalizando los niveles del gen ND1 mitocondrial (mtND1) a los niveles de microglobulina beta-2 nuclear (B2M). Se comparará el número de copias de ADNmt entre individuos con fragilidad y multimorbilidad versus individuos con fragilidad sin multimorbilidad. La fragilidad se derivará en función de la presencia de al menos tres criterios entre: pérdida de peso involuntaria ≥ 4,5 kg, debilidad muscular medida mediante agarre manual, fatiga autoinformada ≥ 3 días por semana, baja actividad física (evaluada con el cuestionario IPAQ), y velocidad de marcha reducida (medida mediante la prueba de marcha de 4 m). La multimorbilidad se definirá como la presencia de al menos dos enfermedades crónicas. |
Base
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Medidas de resultado secundarias
Medida de resultado |
Medida Descripción |
Periodo de tiempo |
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Variación en la intensidad media de la fluorescencia mitocondrial entre individuos frágiles y no frágiles sin multimorbilidad
Periodo de tiempo: Base
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Se teñirán 500.000 PBMC obtenidas de los participantes del estudio con anticuerpos CD45, CD3, CD19 y CD14 y se incubarán con Mitotracker Deep Red 100 nM (Thermo Fisher Scientific) durante 30 minutos a 30 °C.
Las células también se marcarán con tinte vivo/muerto y se analizarán mediante citometría de flujo con el clasificador de células MoFLO Astrios.
La masa mitocondrial, evaluada como la intensidad de fluorescencia media (MFI) de Mitotracker Deep Red, se evaluará en PBMC totales, linfocitos T y B y monocitos.
Se adquirirán 40.000 eventos en cada puerta de población y se realizará un análisis fuera de línea con el software Kaluza.
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Base
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Variación en la intensidad media de la fluorescencia mitocondrial entre individuos frágiles con y sin multimorbilidad
Periodo de tiempo: Base
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Se teñirán 500.000 PBMC obtenidas de los participantes del estudio con anticuerpos CD45, CD3, CD19 y CD14 y se incubarán con Mitotracker Deep Red 100 nM (Thermo Fisher Scientific) durante 30 minutos a 30 °C.
Las células también se marcarán con tinte vivo/muerto y se analizarán mediante citometría de flujo con el clasificador de células MoFLO Astrios.
La masa mitocondrial, evaluada como la intensidad de fluorescencia media (MFI) de Mitotracker Deep Red, se evaluará en PBMC totales, linfocitos T y B y monocitos.
Se adquirirán 40.000 eventos en cada puerta de población y se realizará un análisis fuera de línea con el software Kaluza.
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Base
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Diferencia de especies reactivas de oxígeno (ROS) intracelulares entre individuos frágiles y no frágiles sin multimorbilidad
Periodo de tiempo: Base
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El indicador fluorescente permeable a las células diacetato de 2',7'-diclorofluorescina (DCFH-DA) se utilizará para detectar ROS intracelulares.
DCFH-DA es desacetilado por esterasas celulares a un compuesto no fluorescente, que luego es oxidado por ROS en 2',7'-diclorofluoresceína (DCF) fluorescente.
La intensidad de la señal fluorescente generada se correlaciona con el nivel intracelular de ROS.
Se teñirán 500.000 PBMC obtenidas de 25 sujetos NFWoM, 25 FWM y 25 FWoM con anticuerpos CD45, CD3, CD19 y CD14 y se incubarán con diacetato de 2',7'-diclorofluorescina 10 μM (DCFH-DA) a 37 °C durante 30 minutos. .
Las células también se marcarán con tinte vivo/muerto y se analizarán mediante citometría de flujo.
Las ROS intracelulares, evaluadas como la intensidad de fluorescencia media (MFI) de DCF, se evaluarán en PBMC totales, linfocitos T y B y monocitos.
Se adquirirán 40.000 eventos en cada puerta de población y se realizará un análisis fuera de línea con el software Kaluza.
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Base
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Diferencia de especies reactivas de oxígeno (ROS) intracelulares entre individuos frágiles con y sin multimorbilidad
Periodo de tiempo: Base
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El indicador fluorescente permeable a las células diacetato de 2',7'-diclorofluorescina (DCFH-DA) se utilizará para detectar ROS intracelulares.
DCFH-DA es desacetilado por esterasas celulares a un compuesto no fluorescente, que luego es oxidado por ROS en 2',7'-diclorofluoresceína (DCF) fluorescente.
La intensidad de la señal fluorescente generada se correlaciona con el nivel intracelular de ROS.
Se teñirán 500.000 PBMC obtenidas de 25 sujetos NFWoM, 25 FWM y 25 FWoM con anticuerpos CD45, CD3, CD19 y CD14 y se incubarán con diacetato de 2',7'-diclorofluorescina 10 μM (DCFH-DA) a 37 °C durante 30 minutos. .
Las células también se marcarán con tinte vivo/muerto y se analizarán mediante citometría de flujo.
Las ROS intracelulares, evaluadas como la intensidad de fluorescencia media (MFI) de DCF, se evaluarán en PBMC totales, linfocitos T y B y monocitos.
Se adquirirán 40.000 eventos en cada puerta de población y se realizará un análisis fuera de línea con el software Kaluza.
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Base
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Diferencia cualitativa en los perfiles metabolómicos de PBMC y subpoblaciones de PBMC entre individuos frágiles y no frágiles sin multimorbilidad
Periodo de tiempo: Base
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Se realizará metabolómica basada en LC-MS no dirigida en PBMC y en linfocitos y monocitos T y B, obtenidos como se describe en la Tarea 2. Las muestras de células se apagarán con metanol frío.
Después de la precipitación de proteínas, los metabolitos se extraerán y analizarán mediante espectrometría de masas por cromatografía líquida (LC-MS).
Se utilizará cromatografía de interacción hidrofílica (HILIC) para resolver el metaboloma polar antes de la detección de MS utilizando un instrumento Agilent 6546 lc/q-tof (Agilent). El contenido de proteína total se cuantificará con NanoDrop™ (Thermofisher) y se utilizará para normalizar el metabolismo. perfil de cada muestra.
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Base
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Diferencia cualitativa en los perfiles metabolómicos de PBMC y subpoblaciones de PBMC entre individuos frágiles con y sin multimorbilidad
Periodo de tiempo: Base
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Se realizará metabolómica basada en LC-MS no dirigida en PBMC y en linfocitos y monocitos T y B, obtenidos como se describe en la Tarea 2. Las muestras de células se apagarán con metanol frío.
Después de la precipitación de proteínas, los metabolitos se extraerán y analizarán mediante espectrometría de masas por cromatografía líquida (LC-MS).
Se utilizará cromatografía de interacción hidrofílica (HILIC) para resolver el metaboloma polar antes de la detección de MS utilizando un instrumento Agilent 6546 lc/q-tof (Agilent). El contenido de proteína total se cuantificará con NanoDrop™ (Thermofisher) y se utilizará para normalizar el metabolismo. perfil de cada muestra.
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Base
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Colaboradores e Investigadores
Patrocinador
Colaboradores
Investigadores
- Investigador principal: Caterina Trevisan, PhD, Università degli Studi di Ferrara
Fechas de registro del estudio
Fechas importantes del estudio
Inicio del estudio (Estimado)
Finalización primaria (Estimado)
Finalización del estudio (Estimado)
Fechas de registro del estudio
Enviado por primera vez
Primero enviado que cumplió con los criterios de control de calidad
Publicado por primera vez (Actual)
Actualizaciones de registros de estudio
Última actualización publicada (Actual)
Última actualización enviada que cumplió con los criterios de control de calidad
Última verificación
Más información
Términos relacionados con este estudio
Palabras clave
Términos MeSH relevantes adicionales
Otros números de identificación del estudio
- 653/2023/Oss/AOUFe
Información sobre medicamentos y dispositivos, documentos del estudio
Estudia un producto farmacéutico regulado por la FDA de EE. UU.
Estudia un producto de dispositivo regulado por la FDA de EE. UU.
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