Desregulação Metabólica como Biomarcador de Fragilidade: Papel da Disfunção Mitocondrial (FRAMITO)
O objetivo deste estudo observacional é avaliar a presença de disfunção mitocondrial relacionada ao estresse oxidativo e seu possível papel na fragilidade, com e sem multimorbidade, e identificar possíveis biomarcadores de fragilidade correlacionados com a disfunção mitocondrial. As principais questões que pretende responder são:
- Qual o papel da disfunção mitocondrial relacionada ao estresse oxidativo na fragilidade, levando em consideração a interação com a multimorbidade.
- Quais poderiam ser os biomarcadores específicos associados à disfunção mitocondrial na avaliação da fragilidade.
Para atingir os objetivos do estudo, inscreveremos três categorias de idosos:
- Não Frágil sem Multimorbidade (NFWoM);
- Frágil com Multimorbidade (FWM);
- Frágil sem Multimorbidade (FWoM).
Cada indivíduo será submetido a avaliação do fenótipo de fragilidade e multimorbidade, além da coleta de amostras de sangue para isolamento de células mononucleares do sangue periférico (PBMCs). A identificação de biomarcadores de fragilidade em cada grupo de participantes será realizada combinando abordagens não direcionadas baseadas em metabolômica e estudos funcionais sobre disfunções mitocondriais específicas realizadas em PBMCs e suas subpopulações. Técnicas estatísticas multivariadas e de aprendizado de máquina caracterizarão os três grupos de fenótipos clínicos com base em dados moleculares.
Visão geral do estudo
Status
Descrição detalhada
Tipo de estudo: estudo prospectivo observacional. Objetivo principal: avaliar a presença de disfunção mitocondrial relacionada ao estresse oxidativo e seu possível papel na fragilidade, com e sem multimorbidade.
Endpoint primário: disfunção mitocondrial na fragilidade. Objetivos secundários: combinar abordagens não direcionadas baseadas em metabolômica e estudos funcionais sobre disfunções mitocondriais específicas realizadas em PBMCs e subpopulações de PBMCs (linfócitos B, linfócitos T e monócitos).
As atividades de investigação estão organizadas nas seguintes tarefas:
- Tarefa 1, Inscrição de Pacientes: Inscreveremos indivíduos com 65 anos ou mais de ambulatórios geriátricos ou enfermarias geriátricas. Para cada indivíduo, realizaremos uma avaliação de fragilidade e multimorbidade, e coletaremos amostras de sangue para isolar células mononucleares do sangue periférico (PBMCs). Serão inscritas três categorias de indivíduos: 25 indivíduos não frágeis sem multimorbidade (NFWoM), 25 indivíduos frágeis com multimorbidade (FWM) e 25 indivíduos frágeis sem multimorbidade (FWoM).
- Tarefa 2, Separação de subpopulações de PBMC: Linfócitos T, linfócitos B e monócitos serão separados de PBMCs congelados usando o Cell Sorting Facility para separação de células ativadas por fluorescência (FACS) e o classificador de células MoFlo Astrios. As análises em linfócitos T CD45+/CD3+/CD19-/CD14-, linfócitos CD45+/CD3-/CD19+/CD14-B, monócitos CD45+/CD3-/CD19-/CD14+.
- Tarefa 3, Análise de disfunção mitocondrial em PBMCs e subpopulações de PBMCs: Para cada indivíduo, a disfunção mitocondrial será avaliada analisando danos ao mtDNA (por PCR em tempo real), alteração da massa mitocondrial (por coloração com Mitotracker) e espécies reativas de oxigênio intracelular e mitocondrial ( por coloração DCF e MitoSOX). Além disso, avaliaremos a alteração do metabolismo glicolítico e mitocondrial utilizando o Analisador de Fluxo Extracelular Agilent Seahorse XFe96.
- Tarefa 4, Metabolômica não direcionada em PBMCs e subpopulações de PBMCs: Para avaliar a assinatura metabólica de PBMCs e subpopulações e destacar desregulações metabólicas ligadas à fragilidade, realizaremos metabolômica não direcionada baseada em LC-MS em PBMCs, linfócitos T, linfócitos B e monócitos. A análise do metaboloma polar permitirá compreender melhor as alterações metabólicas associadas à desregulação mitocondrial.
- Tarefa 5, Caracterização de Biomarcadores e Mecanismo Molecular de Fragilidade: Os potenciais biomarcadores de fragilidade e os mecanismos moleculares envolvidos na disfunção mitocondrial serão estudados utilizando técnicas estatísticas e de aprendizado de máquina em dados moleculares, metabólicos e clínicos. Esta etapa ajudará a caracterizar os fenótipos clínicos com base em medições moleculares.
Tipo de estudo
Inscrição (Estimado)
Contactos e Locais
Contato de estudo
- Nome: Caterina Trevisan, PhD
- Número de telefone: 00393896743650
- E-mail: caterina.trevisan@unife.it
Critérios de participação
Critérios de elegibilidade
Idades elegíveis para estudo
- Adulto mais velho
Aceita Voluntários Saudáveis
Método de amostragem
População do estudo
Descrição
Critério de inclusão:
- Idade ≥ 65 anos
- Condições clínicas estáveis
- Disponibilidade para participar do estudo (fornecimento de consentimento informado)
- Proficiência na língua italiana
Critério de exclusão:
- Condições clínicas agudas ou instáveis
Plano de estudo
Como o estudo é projetado?
Detalhes do projeto
Coortes e Intervenções
Grupo / Coorte |
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Não Frágil sem Multimorbidade (NFWoM)
Indivíduos com 65 anos ou mais sem fragilidade e sem multimorbidade.
Este grupo servirá de referência para participantes que não sejam frágeis e não tenham múltiplas condições crônicas.
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Frágil com Multimorbidade (FWM)
Indivíduos frágeis com 65 anos ou mais que apresentam multimorbidade.
Este grupo incluirá participantes que apresentem fragilidade e tenham duas ou mais doenças crônicas.
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Frágil sem Multimorbidade (FWoM)
Indivíduos frágeis com 65 anos ou mais sem multimorbidade.
Este grupo ajudará a avaliar a fragilidade na ausência de múltiplas condições crónicas.
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O que o estudo está medindo?
Medidas de resultados primários
Medida de resultado |
Descrição da medida |
Prazo |
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Diferença no número de cópias do mtDNA entre indivíduos frágeis com e sem multimorbidade
Prazo: Linha de base
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Cópias de mtDNA isoladas de PBMCs totais e de linfócitos T e B e monócitos, obtidas dos participantes, com JetQuick™ Blood and Cell Culture DNA Midiprep Kit (Invitrogen), e 10 ng de DNA serão usados para análise no QuantumStudio 7 Real Time PCR (Biossistemas Aplicados). O número de cópias do mtDNA será calculado normalizando os níveis do gene mitocondrial ND1 (mtND1) para os níveis nucleares de microglobulina Beta-2 (B2M). O número de cópias de mtDNA será comparado entre indivíduos com fragilidade e multimorbidade versus indivíduos com fragilidade sem multimorbidade. A fragilidade será derivada com base na presença de pelo menos três critérios entre: perda de peso involuntária ≥ 4,5 kg, fraqueza muscular medida por preensão manual, fadiga autorreferida em ≥ 3 dias por semana, baixa atividade física (avaliada com o questionário IPAQ), e redução da velocidade da marcha (medida pelo teste de caminhada de 4 m). A multimorbidade será definida como a presença de pelo menos duas doenças crônicas. |
Linha de base
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Diferença no número de cópias do mtDNA entre indivíduos não frágeis e frágeis sem multimorbidade
Prazo: Linha de base
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Cópias de mtDNA isoladas de PBMCs totais e de linfócitos T e B e monócitos, obtidas dos participantes, com JetQuick™ Blood and Cell Culture DNA Midiprep Kit (Invitrogen), e 10 ng de DNA serão usados para análise no QuantumStudio 7 Real Time PCR (Biossistemas Aplicados). O número de cópias do mtDNA será calculado normalizando os níveis do gene mitocondrial ND1 (mtND1) para os níveis nucleares de microglobulina Beta-2 (B2M). O número de cópias de mtDNA será comparado entre indivíduos com fragilidade e multimorbidade versus indivíduos com fragilidade sem multimorbidade. A fragilidade será derivada com base na presença de pelo menos três critérios entre: perda de peso involuntária ≥ 4,5 kg, fraqueza muscular medida por preensão manual, fadiga autorreferida em ≥ 3 dias por semana, baixa atividade física (avaliada com o questionário IPAQ), e redução da velocidade da marcha (medida pelo teste de caminhada de 4 m). A multimorbidade será definida como a presença de pelo menos duas doenças crônicas. |
Linha de base
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Medidas de resultados secundários
Medida de resultado |
Descrição da medida |
Prazo |
|---|---|---|
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Variação na intensidade média da fluorescência mitocondrial entre indivíduos não frágeis vs frágeis sem multimorbidade
Prazo: Linha de base
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500.000 PBMCs obtidos dos participantes do estudo serão corados com anticorpos CD45, CD3, CD19 e CD14 e incubados com Mitotracker Deep Red 100 nM (Thermo Fisher Scientific) por 30 minutos a 30°C.
As células também serão marcadas com corante Live/Dead e analisadas por citometria de fluxo com classificador de células MoFLO Astrios.
A massa mitocondrial, avaliada como a intensidade mediana de fluorescência (MFI) do Mitotracker Deep Red, será avaliada em PBMCs totais, linfócitos T e B e monócitos.
Serão adquiridos 40.000 eventos em cada portão populacional e a análise offline será realizada com o software Kaluza.
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Linha de base
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Variação na intensidade média da fluorescência mitocondrial entre indivíduos frágeis com e sem multimorbidade
Prazo: Linha de base
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500.000 PBMCs obtidos dos participantes do estudo serão corados com anticorpos CD45, CD3, CD19 e CD14 e incubados com Mitotracker Deep Red 100 nM (Thermo Fisher Scientific) por 30 minutos a 30°C.
As células também serão marcadas com corante Live/Dead e analisadas por citometria de fluxo com classificador de células MoFLO Astrios.
A massa mitocondrial, avaliada como a intensidade mediana de fluorescência (MFI) do Mitotracker Deep Red, será avaliada em PBMCs totais, linfócitos T e B e monócitos.
Serão adquiridos 40.000 eventos em cada portão populacional e a análise offline será realizada com o software Kaluza.
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Linha de base
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Diferença de espécies reativas de oxigênio intracelular (ROS) entre indivíduos não frágeis e frágeis sem multimorbidade
Prazo: Linha de base
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O indicador fluorescente permeável às células diacetato de 2',7'-diclorofluorescina (DCFH-DA) será utilizado para detecção de ERO intracelulares.
DCFH-DA é desacetilado por esterases celulares em um composto não fluorescente, que é posteriormente oxidado por ROS em 2',7'-diclorofluoresceína fluorescente (DCF).
A intensidade do sinal fluorescente gerado correlaciona-se com o nível intracelular de ERO.
500.000 PBMCs obtidos de 25 indivíduos NFWoM, 25 FWM e 25 FWoM serão corados com anticorpos CD45, CD3, CD19 e CD14 e incubados com 10 μM de diacetato de 2',7'-diclorofluorescina (DCFH-DA) a 37°C por 30 minutos .
As células também serão marcadas com corante Vivo/Morto e analisadas por citometria de fluxo.
As ERO intracelulares, avaliadas como a intensidade mediana de fluorescência (MFI) do DCF, serão avaliadas em PBMCs totais, linfócitos T e B e monócitos.
Serão adquiridos 40.000 eventos em cada portão populacional e a análise offline será realizada com o software Kaluza.
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Linha de base
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Diferença de espécies reativas de oxigênio intracelular (ROS) entre indivíduos frágeis com e sem multimorbidade
Prazo: Linha de base
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O indicador fluorescente permeável às células diacetato de 2',7'-diclorofluorescina (DCFH-DA) será utilizado para detecção de ERO intracelulares.
DCFH-DA é desacetilado por esterases celulares em um composto não fluorescente, que é posteriormente oxidado por ROS em 2',7'-diclorofluoresceína fluorescente (DCF).
A intensidade do sinal fluorescente gerado correlaciona-se com o nível intracelular de ERO.
500.000 PBMCs obtidos de 25 indivíduos NFWoM, 25 FWM e 25 FWoM serão corados com anticorpos CD45, CD3, CD19 e CD14 e incubados com 10 μM de diacetato de 2',7'-diclorofluorescina (DCFH-DA) a 37°C por 30 minutos .
As células também serão marcadas com corante Vivo/Morto e analisadas por citometria de fluxo.
As ERO intracelulares, avaliadas como a intensidade mediana de fluorescência (MFI) do DCF, serão avaliadas em PBMCs totais, linfócitos T e B e monócitos.
Serão adquiridos 40.000 eventos em cada portão populacional e a análise offline será realizada com o software Kaluza.
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Linha de base
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Diferença qualitativa nos perfis metabolômicos de PBMCs e subpopulações de PBMCs entre indivíduos não frágeis e frágeis sem multimorbidade
Prazo: Linha de base
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A metabolômica baseada em LC-MS não direcionada será realizada em PBMCs e em linfócitos e monócitos T e B, obtidos conforme descrito na Tarefa 2. As amostras de células serão extintas usando metanol frio.
Após a precipitação das proteínas, os metabólitos serão extraídos e analisados por espectrometria de massa por cromatografia líquida (LC-MS).
A cromatografia de interação hidrofílica (HILIC) será usada para resolver o metaboloma polar antes da detecção de MS usando um instrumento Agilent 6546 lc/q-tof (Agilent). Todo o conteúdo de proteína será quantificado com NanoDrop™ (Thermofisher) e usado para normalizar o metabolismo perfil de cada amostra.
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Linha de base
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Diferença qualitativa nos perfis metabolômicos de PBMCs e subpopulações de PBMCs entre indivíduos frágeis com vs sem multimorbidade
Prazo: Linha de base
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A metabolômica baseada em LC-MS não direcionada será realizada em PBMCs e em linfócitos e monócitos T e B, obtidos conforme descrito na Tarefa 2. As amostras de células serão extintas usando metanol frio.
Após a precipitação das proteínas, os metabólitos serão extraídos e analisados por espectrometria de massa por cromatografia líquida (LC-MS).
A cromatografia de interação hidrofílica (HILIC) será usada para resolver o metaboloma polar antes da detecção de MS usando um instrumento Agilent 6546 lc/q-tof (Agilent). Todo o conteúdo de proteína será quantificado com NanoDrop™ (Thermofisher) e usado para normalizar o metabolismo perfil de cada amostra.
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Linha de base
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Colaboradores e Investigadores
Patrocinador
Colaboradores
Investigadores
- Investigador principal: Caterina Trevisan, PhD, Università degli Studi di Ferrara
Datas de registro do estudo
Datas Principais do Estudo
Início do estudo (Estimado)
Conclusão Primária (Estimado)
Conclusão do estudo (Estimado)
Datas de inscrição no estudo
Enviado pela primeira vez
Enviado pela primeira vez que atendeu aos critérios de CQ
Primeira postagem (Real)
Atualizações de registro de estudo
Última Atualização Postada (Real)
Última atualização enviada que atendeu aos critérios de controle de qualidade
Última verificação
Mais Informações
Termos relacionados a este estudo
Palavras-chave
Termos MeSH relevantes adicionais
Outros números de identificação do estudo
- 653/2023/Oss/AOUFe
Informações sobre medicamentos e dispositivos, documentos de estudo
Estuda um medicamento regulamentado pela FDA dos EUA
Estuda um produto de dispositivo regulamentado pela FDA dos EUA
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