Disregolazione metabolica come biomarcatore di fragilità: ruolo della disfunzione mitocondriale (FRAMITO)
L'obiettivo di questo studio osservazionale è valutare la presenza di disfunzione mitocondriale correlata allo stress ossidativo e il suo possibile ruolo nella fragilità, con e senza multimorbilità, e identificare possibili biomarcatori di fragilità correlati alla disfunzione mitocondriale. Le principali domande a cui si propone di rispondere sono:
- Qual è il ruolo della disfunzione mitocondriale correlata allo stress ossidativo nella fragilità, tenendo conto dell'interazione con la multimorbilità.
- Quali potrebbero essere i biomarcatori specifici associati alla disfunzione mitocondriale nella valutazione della fragilità.
Per raggiungere gli obiettivi dello studio, arruoleremo tre categorie di anziani:
- Non Fragile senza Multimorbilità (NFWoM);
- Fragili con Multimorbilità (FWM);
- Fragili senza Multimorbilità (FWoM).
Ogni individuo sarà sottoposto a una valutazione del fenotipo di fragilità e della multimorbilità e alla raccolta di campioni di sangue per isolare le cellule mononucleari del sangue periferico (PBMC). L'identificazione dei biomarcatori di fragilità in ciascun gruppo di partecipanti verrà eseguita combinando approcci basati sulla metabolomica non mirati e studi funzionali su specifiche disfunzioni mitocondriali eseguiti su PBMC e sulle loro sottopopolazioni. Tecniche statistiche multivariate e di apprendimento automatico caratterizzeranno i tre gruppi di fenotipi clinici sulla base di dati molecolari.
Panoramica dello studio
Stato
Descrizione dettagliata
Tipo di studio: studio prospettico osservazionale. Obiettivo primario: valutare la presenza di disfunzione mitocondriale correlata allo stress ossidativo e il suo possibile ruolo nella fragilità, con e senza multimorbilità.
Endpoint primario: disfunzione mitocondriale nella fragilità. Obiettivi secondari: combinare approcci basati sulla metabolomica non mirati e studi funzionali su specifiche disfunzioni mitocondriali eseguiti su PBMC e sottopopolazioni di PBMC (linfociti B, linfociti T e monociti).
Le attività di ricerca sono organizzate nei seguenti compiti:
- Attività 1, Arruolamento dei pazienti: registreremo individui di età pari o superiore a 65 anni provenienti da ambulatori geriatrici o reparti geriatrici. Per ciascun individuo, eseguiremo una valutazione della fragilità e della multimorbilità e raccoglieremo campioni di sangue per isolare le cellule mononucleari del sangue periferico (PBMC). Verranno arruolate tre categorie di individui: 25 individui non fragili senza multimorbilità (NFWoM), 25 individui fragili con multimorbilità (FWM) e 25 individui fragili senza multimorbilità (FWoM).
- Attività 2, Separazione delle sottopopolazioni PBMC: i linfociti T, i linfociti B e i monociti saranno separati dai PBMC congelati utilizzando la separazione FACS (Cell Sorting Facility for Fluorescent-Activated Cell Sorting) e il cell sorter MoFlo Astrios. Le analisi su linfociti T CD45+/CD3+/CD19-/CD14-, linfociti B CD45+/CD3-/CD19+/CD14-, monociti CD45+/CD3-/CD19-/CD14+.
- Task 3, Analisi della disfunzione mitocondriale su PBMC e sottopopolazioni PBMC: per ciascun individuo, la disfunzione mitocondriale sarà valutata analizzando il danno del mtDNA (mediante Real-Time PCR), l'alterazione della massa mitocondriale (mediante colorazione Mitotracker) e le specie reattive dell'ossigeno intracellulari e mitocondriali ( mediante colorazione DCF e MitoSOX). Inoltre, valuteremo l'alterazione del metabolismo glicolitico e mitocondriale utilizzando l'analizzatore di flusso extracellulare Agilent Seahorse XFe96.
- Attività 4, Metabolomica non mirata su PBMC e sottopopolazioni PBMC: per valutare la firma metabolica di PBMC e sottopopolazioni ed evidenziare disregolazioni metaboliche legate alla fragilità, eseguiremo metabolomica non mirata basata su LC-MS su PBMC, linfociti T, linfociti B e monociti. L'analisi sul metaboloma polare ci permetterà di comprendere meglio le alterazioni metaboliche associate alla disregolazione mitocondriale.
- Task 5, Caratterizzazione di biomarcatori e meccanismo molecolare di fragilità: i potenziali biomarcatori di fragilità e i meccanismi molecolari coinvolti nella disfunzione mitocondriale saranno studiati utilizzando tecniche statistiche e di apprendimento automatico su dati molecolari, metabolici e clinici. Questo passaggio aiuterà a caratterizzare i fenotipi clinici sulla base di misurazioni molecolari.
Tipo di studio
Iscrizione (Stimato)
Contatti e Sedi
Contatto studio
- Nome: Caterina Trevisan, PhD
- Numero di telefono: 00393896743650
- Email: caterina.trevisan@unife.it
Criteri di partecipazione
Criteri di ammissibilità
Età idonea allo studio
- Adulto più anziano
Accetta volontari sani
Metodo di campionamento
Popolazione di studio
Descrizione
Criterio di inclusione:
- Età ≥ 65 anni
- Condizioni cliniche stabili
- Disponibilità a partecipare allo studio (fornitura del consenso informato)
- Conoscenza della lingua italiana
Criteri di esclusione:
- Condizioni cliniche acute o instabili
Piano di studio
Come è strutturato lo studio?
Dettagli di progettazione
Coorti e interventi
Gruppo / Coorte |
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Non fragile senza multimorbilità (NFWoM)
Individui di età pari o superiore a 65 anni senza fragilità e senza multimorbilità.
Questo gruppo servirà da riferimento per i partecipanti che non sono fragili e non presentano patologie croniche multiple.
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Fragili con Multimorbilità (FWM)
Individui fragili di età pari o superiore a 65 anni che presentano multimorbilità.
Questo gruppo includerà partecipanti che mostrano fragilità e hanno due o più malattie croniche.
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Fragili senza multimorbilità (FWoM)
Individui fragili di età pari o superiore a 65 anni senza multimorbilità.
Questo gruppo aiuterà a valutare la fragilità in assenza di molteplici condizioni croniche.
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Cosa sta misurando lo studio?
Misure di risultato primarie
Misura del risultato |
Misura Descrizione |
Lasso di tempo |
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Differenza nel numero di copie del mtDNA tra individui fragili con o senza multimorbilità
Lasso di tempo: Linea di base
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Copie del mtDNA isolate da PBMC totali e da linfociti e monociti T e B, ottenute dai partecipanti, con il kit JetQuick™ Blood and Cell Culture DNA Midiprep (Invitrogen) e 10 ng di DNA verranno utilizzati per l'analisi su QuantumStudio 7 Real Time PCR (Biosistemi applicati). Il numero di copie del mtDNA sarà calcolato normalizzando i livelli del gene mitocondriale ND1 (mtND1) ai livelli di microglobulina nucleare Beta-2 (B2M). Il numero di copie del mtDNA sarà confrontato tra individui con fragilità e multimorbilità rispetto a individui con fragilità senza multimorbilità. La fragilità sarà derivata in base alla presenza di almeno tre criteri tra: perdita di peso involontaria ≥ 4,5 kg, debolezza muscolare misurata mediante impugnatura, affaticamento auto-riferito su ≥ 3 giorni alla settimana, bassa attività fisica (valutata con il questionario IPAQ), e ridotta velocità dell'andatura (misurata con il test del cammino di 4 m). La multimorbilità sarà definita come la presenza di almeno due malattie croniche. |
Linea di base
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Differenza nel numero di copie del mtDNA tra individui non fragili e individui fragili senza multimorbilità
Lasso di tempo: Linea di base
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Copie del mtDNA isolate da PBMC totali e da linfociti e monociti T e B, ottenute dai partecipanti, con il kit JetQuick™ Blood and Cell Culture DNA Midiprep (Invitrogen) e 10 ng di DNA verranno utilizzati per l'analisi su QuantumStudio 7 Real Time PCR (Biosistemi applicati). Il numero di copie del mtDNA sarà calcolato normalizzando i livelli del gene mitocondriale ND1 (mtND1) ai livelli di microglobulina nucleare Beta-2 (B2M). Il numero di copie del mtDNA sarà confrontato tra individui con fragilità e multimorbilità rispetto a individui con fragilità senza multimorbilità. La fragilità sarà derivata in base alla presenza di almeno tre criteri tra: perdita di peso involontaria ≥ 4,5 kg, debolezza muscolare misurata mediante impugnatura, affaticamento auto-riferito su ≥ 3 giorni alla settimana, bassa attività fisica (valutata con il questionario IPAQ), e ridotta velocità dell'andatura (misurata con il test del cammino di 4 m). La multimorbilità sarà definita come la presenza di almeno due malattie croniche. |
Linea di base
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Misure di risultato secondarie
Misura del risultato |
Misura Descrizione |
Lasso di tempo |
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Variazione nell'intensità media della fluorescenza mitocondriale tra individui non fragili e individui fragili senza multimorbilità
Lasso di tempo: Linea di base
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500.000 PBMC ottenuti dai partecipanti allo studio saranno colorati con anticorpi CD45, CD3, CD19 e CD14 e incubati con Mitotracker Deep Red 100 nM (Thermo Fisher Scientific) per 30 minuti a 30°C.
Le cellule saranno inoltre marcate con colorante vivo/morto e analizzate mediante citometria a flusso con il cell sorter MoFLO Astrios.
La massa mitocondriale, valutata come intensità mediana di fluorescenza (MFI) del Mitotracker Deep Red, sarà valutata in PBMC totali, linfociti T e B e monociti.
Verranno acquisiti 40.000 eventi in ciascun cancello della popolazione e l'analisi offline verrà eseguita con il software Kaluza.
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Linea di base
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Variazione nell'intensità media della fluorescenza mitocondriale tra individui fragili con o senza multimorbilità
Lasso di tempo: Linea di base
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500.000 PBMC ottenuti dai partecipanti allo studio saranno colorati con anticorpi CD45, CD3, CD19 e CD14 e incubati con Mitotracker Deep Red 100 nM (Thermo Fisher Scientific) per 30 minuti a 30°C.
Le cellule saranno inoltre marcate con colorante vivo/morto e analizzate mediante citometria a flusso con il cell sorter MoFLO Astrios.
La massa mitocondriale, valutata come intensità mediana di fluorescenza (MFI) del Mitotracker Deep Red, sarà valutata in PBMC totali, linfociti T e B e monociti.
Verranno acquisiti 40.000 eventi in ciascun cancello della popolazione e l'analisi offline verrà eseguita con il software Kaluza.
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Linea di base
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Differenza delle specie reattive dell'ossigeno intracellulare (ROS) tra individui non fragili e individui fragili senza multimorbilità
Lasso di tempo: Linea di base
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L'indicatore fluorescente permeabile alle cellule 2',7'-diclorofluorescina diacetato (DCFH-DA) verrà utilizzato per rilevare i ROS intracellulari.
DCFH-DA viene deacetilato dalle esterasi cellulari in un composto non fluorescente, che viene successivamente ossidato dai ROS in 2',7'-diclorofluoresceina fluorescente (DCF).
L'intensità del segnale fluorescente generato è correlata al livello intracellulare di ROS.
500.000 PBMC ottenuti da 25 soggetti NFWoM, 25 FWM e 25 FWoM saranno colorati con anticorpi CD45, CD3, CD19 e CD14 e incubati con 10 μM di 2',7'-diclorofluorescina diacetato (DCFH-DA) a 37°C per 30 minuti .
Le cellule saranno inoltre marcate con colorante vivo/morto e analizzate mediante citometria a flusso.
I ROS intracellulari, valutati come intensità mediana di fluorescenza (MFI) di DCF, saranno valutati in PBMC totali, linfociti T e B e monociti.
Verranno acquisiti 40.000 eventi in ciascun cancello della popolazione e l'analisi offline verrà eseguita con il software Kaluza.
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Linea di base
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Differenza delle specie reattive dell'ossigeno intracellulare (ROS) tra individui fragili con o senza multimorbilità
Lasso di tempo: Linea di base
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L'indicatore fluorescente permeabile alle cellule 2',7'-diclorofluorescina diacetato (DCFH-DA) verrà utilizzato per rilevare i ROS intracellulari.
DCFH-DA viene deacetilato dalle esterasi cellulari in un composto non fluorescente, che viene successivamente ossidato dai ROS in 2',7'-diclorofluoresceina fluorescente (DCF).
L'intensità del segnale fluorescente generato è correlata al livello intracellulare di ROS.
500.000 PBMC ottenuti da 25 soggetti NFWoM, 25 FWM e 25 FWoM saranno colorati con anticorpi CD45, CD3, CD19 e CD14 e incubati con 10 μM di 2',7'-diclorofluorescina diacetato (DCFH-DA) a 37°C per 30 minuti .
Le cellule saranno inoltre marcate con colorante vivo/morto e analizzate mediante citometria a flusso.
I ROS intracellulari, valutati come intensità mediana di fluorescenza (MFI) di DCF, saranno valutati in PBMC totali, linfociti T e B e monociti.
Verranno acquisiti 40.000 eventi in ciascun cancello della popolazione e l'analisi offline verrà eseguita con il software Kaluza.
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Linea di base
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Differenza qualitativa nei profili metabolomici dei PBMC e delle sottopopolazioni PBMC tra individui non fragili e individui fragili senza multimorbilità
Lasso di tempo: Linea di base
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La metabolomica non mirata basata su LC-MS verrà eseguita su PBMC e su linfociti e monociti T e B, ottenuti come descritto nell'Attività 2. I campioni cellulari verranno quenchati utilizzando metanolo freddo.
Dopo la precipitazione delle proteine, i metaboliti verranno estratti e analizzati mediante cromatografia liquida e spettrometria di massa (LC-MS).
La cromatografia di interazione idrofila (HILIC) verrà utilizzata per risolvere il metaboloma polare prima del rilevamento della MS utilizzando uno strumento Agilent 6546 lc/q-tof (Agilent). L'intero contenuto proteico sarà quantificato con NanoDrop™ (Thermofisher) e utilizzato per normalizzare il metabolismo profilo di ciascun campione.
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Linea di base
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Differenza qualitativa nei profili metabolomici dei PBMC e delle sottopopolazioni PBMC tra individui fragili con o senza multimorbilità
Lasso di tempo: Linea di base
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La metabolomica non mirata basata su LC-MS verrà eseguita su PBMC e su linfociti e monociti T e B, ottenuti come descritto nell'Attività 2. I campioni cellulari verranno quenchati utilizzando metanolo freddo.
Dopo la precipitazione delle proteine, i metaboliti verranno estratti e analizzati mediante cromatografia liquida e spettrometria di massa (LC-MS).
La cromatografia di interazione idrofila (HILIC) verrà utilizzata per risolvere il metaboloma polare prima del rilevamento della MS utilizzando uno strumento Agilent 6546 lc/q-tof (Agilent). L'intero contenuto proteico sarà quantificato con NanoDrop™ (Thermofisher) e utilizzato per normalizzare il metabolismo profilo di ciascun campione.
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Linea di base
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Collaboratori e investigatori
Sponsor
Collaboratori
Investigatori
- Investigatore principale: Caterina Trevisan, PhD, Università degli Studi di Ferrara
Studiare le date dei record
Studia le date principali
Inizio studio (Stimato)
Completamento primario (Stimato)
Completamento dello studio (Stimato)
Date di iscrizione allo studio
Primo inviato
Primo inviato che soddisfa i criteri di controllo qualità
Primo Inserito (Effettivo)
Aggiornamenti dei record di studio
Ultimo aggiornamento pubblicato (Effettivo)
Ultimo aggiornamento inviato che soddisfa i criteri QC
Ultimo verificato
Maggiori informazioni
Termini relativi a questo studio
Parole chiave
Termini MeSH pertinenti aggiuntivi
Altri numeri di identificazione dello studio
- 653/2023/Oss/AOUFe
Informazioni su farmaci e dispositivi, documenti di studio
Studia un prodotto farmaceutico regolamentato dalla FDA degli Stati Uniti
Studia un dispositivo regolamentato dalla FDA degli Stati Uniti
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