癌症儿童的肠道健康

急性髓样白血病（AML）是一种侵袭性癌症，由于未成熟的白细胞的克隆膨胀，称为爆炸（Chaudhury等，2018），与儿童淋巴性白血病相比，结果通常很差（Arad-Cohen等，2022年）。 虽然小儿AML的完全缓解率在大约90％的情况下较高，但无事件的生存和总生存率分别以45％和65％的速度替代3岁，近一半的儿童将复发（Rasche等，2018）。 最近，在包括AML在内的癌症治疗抗原免疫疗法方面，人们一直在转向抗原免疫疗法，以触发抗白血病反应（Greiner，2019年）。

肠粘膜炎是化学疗法最常见的副作用之一，这是由于肠粘膜屏障的免疫平衡而导致的（De Pietri等，2020）。 这会导致肠粘膜吸收和分泌功能的改变，出血，肠道运动障碍或肠道衰竭（McGrath，2019; Ohta等，2003）。 化学疗法诱导的肠粘膜炎被认为在系统性炎症和感染的发展中起着核心作用（van der Velden等，2014）。 因此，需要对肠粘膜炎的严重程度进行临床评估，这是由于缺乏验证的评分量表而质疑与粘膜炎发病机理有关以评估其严重程度的客观生物标志物。 血浆柠檬氨酸水平的降低与成人和儿童造血干细胞移植后肠粘膜炎和全身性炎症的严重程度有关（Gosselin等，2014; Van Vliet等，2009）。

化学疗法诱导的肠粘膜炎会导致肠道细菌的易位，并使细菌能够越过受损的粘膜屏障，导致全身性炎症，并可能导致全身感染，尤其是在免疫功能低下的患者中（Villa and Sonis，2015年，2015年）。 影响免疫系统的疾病，例如炎症性肠病（IBD），青少年特发性关节炎（JIA）和急性白血病，是影响小儿种群的病理状况，通常与肠道菌群的改变有关，例如细菌多样性的降低（Lucafom等）。 越来越多的证据表明，肠道微生物群可以干扰这些疾病治疗的化学治疗和免疫抑制剂药物，从而降低或促进药物疗效（Peppas等，2023）。 人类肠道菌群由数百种细菌物种组成[（Marchesi等，2016）]。 肠道的微生物群落在肠道上皮和系统的炎症水平上传达了对人类生理的显着益处[（（Kindon等，2007; McDonnell等，2021）（Feng等，2022）]。

小儿癌症患者的临床实践中的喂养策略在化学疗法诱导的粘膜炎差异很大，但总是需要肠道休息，可能需要肠胃外（静脉内）营养（Kuiken等，2017b）（Kuiken等，2017b，2017b）。 肠胃外营养与重大不良反应，即肝损伤，感染风险，代谢危险，肠萎缩，肠道微生物组的营养不良（Tume等，2020）是肠道微生物群是最丰富的抗原抗原呈递细胞。 因此，可以想象的是，肠胃外营养可能会深刻改变肠道微生物组的组成和功能，从而导致对肠道的有害影响（Pierre，2017）。

Tanes等人（2021年）描述了纤维脱落饮食对肠道微生物再持续化的灾难性影响，该团队概述了在疾病后引入正确营养的重要性（Tanes等人，2021年）。 微生物代谢产物的多样性和相对丰度在很大程度上取决于特定的饮食成分[（Morrison和Preston，2016年）]。 不可消化的饮食纤维，例如寡糖和菊粉表现出对人类小肠消化的抗药性[（Lattimer and Haub，2010）]。 在大肠中，饮食纤维经受结肠菌群的发酵，产生短链脂肪酸（SCFA）；醋酸酯，丁酸酯和丙酸酯，充当结肠细胞的主要碳能源[5]。 宿主与肠道SCFA浓度之间的协同关系包括腔内pH的伴随减少，这本身会抑制致病性微生物，并增加某些营养素的吸收[（MacFarlane和MacFarlane，2012）]。 此外，肠道SCFA控制T-助血器细胞，抗体和细胞因子的产生，还参与维持粘膜系统的稳态[（Ríos-Covián等，2016;Corrêa-Olivea-Olivea et al。，2016;Corrêa-Olivea et al。，2016）]。

正在探索基于饮食和微生物组的疗法，以支持在危重疾病期间和之后健康的肠道共生种群的恢复。 在小儿种群中，在使用混合饮食来管理饲料不耐受的过程中正在增长[（Schmitzé等，2021）]。 行业对喂养实践的这种转变做出了反应，并开发了一种具有食品衍生成分的高纤维肠道配方，该配方已被证明可以提高肠内饲料耐受性[（O'Connor等，2022）]。

这是观察AML治疗对儿童肠道微生物组对不同喂养模式（包括肠胃外营养和基于食物的配方）的影响的第一项研究。 最后，这项研究还将观察AML处理后肠道菌群的恢复阶段，并与随后的感染和复发进行比较。

病例：AML儿童：粪便标本将在三个预定义的时间点获得微生物组分析：AML治疗的基线开始（入院后2周内）；诱导化疗开始后（6-8周）；恢复阶段6-8个月。

小儿粪便样品将使用粪便样品收集套件收集。 每个参与者将配备4个家庭收集套件。 每个套件都包含：

• •Fe-Col®Collection套件
• •凳子收集管（包含稳定缓冲液）
• •生物危害袋
• •泡泡邮件袋
• • 指示。

然后，这些样品将被发布回Peplobio的实验室（Royal Mail Priority，Track24）。 到达后，Peplobio人员将继续进行样本接收，包括对样本完整性和戒指的验证。 样品将被匀浆并分成200ul等分试样，并在-20ºC时储存长达7天。

控件：匹配控制粪便样品将发送到Peplobio进行微生物组分析

测定摘要：

案例和控制粪便样品都将发送到Peplobio的高级肠道微生物组面板优惠。 该QPCR多路复用测定目标是16S基因的10个细菌靶标。 这些目标将根据临床，同行评审的相关研究特别选择，这意味着它们参与了代谢性疾病（例如癌症）。 结果将在样本到达实验室后的1-2天内提供绝对的量化数据。

我们计划根据制造商的规格，使用Illumina Miseq平台对细菌16S rRNA基因的V4区域进行测序。 读取将使用序列条形码将每个示例的FASTQ文件反复列入。 向前和反向读取将与Pandaseq一起连接。 在读取少于3000次的样品之后，将排除。 连接的序列文件将使用Python脚本进行格式化，以将带有相应示例ID的Qiime标头添加到每个序列中，然后再将一个文件串为一个文件以输入QIIME 1.8.0a。

Shannon Alpha多样性将使用Alpha_diversity.py在未经过滤的Biom表上计算 用beta_diversity.py计算脚本和加权unifrac距离 脚本。 微生物营养不良指数（最初由Gevers等人描述，将在每个样本中计算R。 微生物营养不良指数将被定义为CD中生物体总丰度的log10除以CD中生物体的总丰度降低。 增加的CD分类单元包括肠杆菌科，巴氏菌科，梭杆菌科，奈瑟氏菌科，Veillonellaceae和Gemellaceae。 C-D分类群的减少是菌叶，梭菌（不包括Veillonellaceae），Erysipelotrichaceae和Bifidobacteriaceae

肠道微生物组组成分析：

微生物多样性将被表示为社区中不同物种的数量（丰富性），其丰度（偶数）的均匀分布或这两个方面的组合，通常称为alpha多样性。 使用香农和辛普森指数估算微生物α多样性，而使用CHAO1指数或观察到的物种/操作分类单元（OTUS）估算微生物丰富度。

为了提取核酸，在制造商的IFU（Thermo Scientific）之后，使用Magmax™病毒/病原体II（MVP II）II（MVP II）核酸分离试剂盒裂解样品，并使用Magmax™病毒/病原体II（MVP II）提取核酸。 QRT-PCR将使用为10个细菌靶标（16S基因）设计的引物执行，并使用标准曲线方法确定定量绝对丰度。

人体测量法（数据收集：T0基线；固结6-8个月的T1末端； T2恢复10-12个月）的重量将确定为最接近的0.1 kg，使用880型电子量表（Seca，Hamburg，hamburg，dermany）在患者之间穿着轻便的衣服或病房礼服的受试者。 使用206型壁挂式标准计（SECA），将测量高度至最接近的0.1厘米，无袜子或鞋子。 体重指数（BMI）将使用标准公式（kg M-2）进行计算。 重量和身高将按照标准程序进行测量。 体重指数将计算为重量为千克，除以米平方的高度，并且将从WHO参考曲线中获得BMI SDS。 BMI和标准偏差分数（SDS）将使用WHO作为参考数据计算。

当WHO儿童成长标准曲线的百分位数高于第99.9位时，肥胖症将得到确认，或者Z分数高于+3（Cole等，2000）。 5岁以上的儿童在WHO儿童成长标准曲线上的BMI在第85％和第97个百分点之间，将被归类为超重，当百分位数高于97或Z得分时，肥胖是肥胖的。 相反，当z得分低于-2SD中部臂周长（MUAC）时，将确认体重，将使用不可用的磁带SECA 212到最接近的0.1 cm饮食数据收集：T0基线：T1基线; T1-Antime of Andemth 6-8month impon;将用于评估儿童的饮食摄入和肠内营养。 在提供的日记中，将指示父母或照料者使用家庭措施记录孩子的食物和孩子的食物和孩子的食用（包括食物的品牌名称，如果适用，包括食物的品牌名称）。 饮食记录将保存两个工作日和一个周末。 饮食摄入分析将使用营养营养分析软件（都柏林，爱尔兰共和国）进行。 将将儿童的能量和营养摄入量与SAGN 2017指南进行比较（SACN，2011年）。

胃肠道耐受性（数据收集：T0基线；固结6-8个月的T1末端； T2恢复10-12个月）凳子一致性是描述正常肠习惯或改变的肠习惯的核心组成部分。 粪便形式可以视为粪便一致性的代理度量，并指粪便的形状和明显纹理，可以在视觉上评估。 粪便形式量表是一种标准化且廉价的方法，将粪便形式分类为可用于医疗保健专业人员和研究人员可以使用的有限类别。

Bristol凳子表量表是粪便类型的序数尺度，范围从最硬（类型1）到最柔软（类型7）。 1型和2型被认为是异常的硬凳子（以及其他症状，表明便秘），而6型和7型被认为是异常松动/液体凳子（以及与其他指示腹泻的症状）。 因此，通常认为3、4和5型是最“正常”的粪便形式，是健康成年人横断面调查中的模态粪便形式。 [22]根据治疗阶段，每周将在病房级别和家里记录僵持模式的耐受性和细节。 喂养不耐受的描述将包括以下变量的报告：粪便一致性和体积（24小时内的粪便数），腹部扩张，气体，呕吐和患者的整体舒适度。

数据收集的其他来源：

化学疗法的影响

• 肠粘膜炎的长度
• 肠胃外营养的时间长度
• 肠内营养的时间长度，包括配方的营养成分
• 感染和抗生素使用
• 与治疗有关的任何其他重大医疗事件

研究设置单中心三级血液学中心 - 大奥蒙德街医院。 采样

数据分析策略样本量根据主要结果计算的样本量 - α多样性主要结果标记：样本量计算将基于总微生物α多样性（丰富度和偶数）之间的关联，以找到对照组和病例参与者之间多样性和案例参与者之间的多样性差异的差异（诱导能力的结束），假设有足够的功率（80％），一个same（80％），一个same（80％），一份（80％）（80％），一份（80％）的尺寸（总计）（占总数）（占50％），一份（80％）的范围（80％）（占50％）（占总数）（80％），均为25 0.82。

（Mattiello等，2016）。 临床微生物组研究中的微生物多样性：样本量和统计能力考虑因素（gastrojournal.org）

25个儿童控制（1个粪便样本）25例儿童病例（3个时间点= 75个粪便样本）

与病例对照状态的Alpha多样性关联将通过线性和无条件的逻辑回归进行测试，并对年龄和性别进行调整。 通过对距离矩阵的未加权和加权UNIFRAC分析（以10 000个排列）对微生物群（β多样性）的组成（β多样性）进行比较。 Mann-Whitney U检验将用于比较该属和物种水平的组成细菌的多样性和比率。 微生物的相对丰度将表示为中位数±范围，Wilcoxon签名的秩检验将用于比较Alpha多样性的情况，而在基线时对照组和6个月的随访以及基线和以后时间点之间的相对丰度的随访和比较。 等，2019）。

Wilcoxon秩和测试用于组之间进行比较，而置换性多变量分析（PermanOva）用于评估OTU和属水平的肠道菌群组成。

化学疗法过程中微生物群多样性和组成的变化：线性混合效应模型使用R版本4.3.1检查了多样性指数的变化。 对于微生物组组成变化，将使用Benjamini-Hochberg方法的错误发现率调整P值负二项式回归模型，并报告为Q值（Benjamini和Hochberg，1995）。

在R的硬币包装中，将使用Shapiro-Wilk检验检查正态性（Hothorn等，2006）。 方差测试的非参数多元分析将通过Adonis函数进行，该函数将设置为9999排列。 数据将根据其各自的分布进行汇总。 对于参数数据，平均值±SD（标准偏差），对于非参数变量，提出了中值±IQR（四分位数范围）。 对于所有统计分析，显着性水平将基于p值≤0.05。

基线菌群对AML诊断时初始风险分层的感染结果的影响，Wilcoxon-Mann-Whitney检验和逻辑回归将用于评估研究期间任何时间发生的随后感染的潜在风险因素，包括基线微生物组。 对于每一个相对丰度在事件中或没有事件的患者中都显着差异的分类单元，将根据Youden指数以最佳的截止值进行二分。 单变量分析中P值<.1的因素将通过多个逻辑回归来检查。 与灰色测试之间的风险因素之间的结局累积发生率将进行比较。

7.3招募研究人员将每天参加病房（电子票据），并查看史诗般的（电子票据），以确定所有家庭的新入院，他们的营养师是患者现有的临床护理团队的成员，他们将检查他们是否需要符合供应量的儿童喂养供应迹象的饲料饲料的喂食迹象。 最初的方法将通过邀请信和参与者的信息表向他们提供研究小组的详细信息，以讨论研究中的详细信息7.3.1样本识别同意书，将向潜在参与者的家庭成员/护理人员提供研究的参与者信息表，并由年龄适当的信息说明：研究：研究：该研究：研究：该研究；它的目的和性质，对参与者的要求；它的风险和负担，协议的主张和局限性；已知的副作用和参与的任何风险。 可以清楚地指出，参与完全是自愿的，能够做出自由选择，并且参与者可以随时自由退出研究，而不会影响或影响他们的护理，而不会影响其权利，并且没有任何要求撤离的要求。 在PI的开头段落中清楚地概述了这一点。

将允许参与者三天考虑信息，并有机会向调查人员提出任何问题。 将需要并获得参与者代表的书面知情同意书，并且获得同意书的人必须由首席/首席调查员获得适当的资格，经验和授权。

知情同意 /同意流程将签署研究知情同意书 /同意表的签名副本，并在参与者的医疗记录中授予参与者的法律代表和副本。 原始签名表格将在研究地点保留在安全的地方。 胜任的成年人（同意书时16岁）在上述完成后，患者将签署并日期为知情同意文件。 获得同意书的人和参与者都必须亲自签名和日期为表格。 知情同意文件的副本将提供给患者记录。 原始副本将提交参与者的医疗票据中，并将在调查员站点文件中提交签名同意书的进一步副本。 同意书的一份副本应寄给YP（同意书时年龄<16岁），该副本已获得16岁以下的年轻人的知情同意书，由父母责任或法律代表提供。

除非临床护理小组认为另有称为临床护理小组，否则6岁及以上的儿童将接受同意，否则他们将在同意之前（除了获得适当成年人的法律同意）之前，他们将不会进入研究。

由年龄段的审查信息表和同意表格提出了有利的意见，描述了（用简化的术语）研究干预，研究程序和风险的细节，可供使用。 YP应亲自在同意表上写下他们的姓名和日期，然后由父母/法律代表和研究人员签署。

当最初开始治疗时，年轻的年轻人将使用特定的PI和同意书同意书（硬拷贝）表格（硬拷贝）表格重新持续一致，并将在研究期间锁定的抽签中锁定。 研究结束后，将将同意书转移到研发中，达到饮食研究存储 - 饮食学涵盖的年费为25英镑。

可能会在足够了解英语方面遇到困难的参与者将得到GOSH Trust解释服务的支持。 “ thebigword”是信托基金的唯一电话解释供应商，该服务将使您能够帮助任何可能具有有限英语技能的客户。 0800 694 5093同意书将记录在患者的电子笔记和研究记录中。

8道德和法规考虑此协议和相关文件将提交伦理审查，以审查综合研究申请系统（IRAS）和卫生研究局（HRA）。

评估和管理风险

8.1研究伦理委员会（REC）和其他监管审查与报告

• 在研究开始之前，将从rec中寻求一个有利的意见
• 在研究开始之前，将寻求卫生研究局（HRA）和威尔士卫生与护理研究研究所（HCRW）的批准，以基于项目的研究在英格兰和威尔士的NHS进行。

对于NHS rec审查了研究

• 需要NHS Rec和HRA进行审查的实质性修正案，直到对该审查进行审查并在现场实施其他机制才能实施。
• 与REC和HRA的所有通信将被保留。
• 首席调查员有责任根据需要制作年度报告。
• 首席研究人员将通知研究结束的REC。
• 年度进度报告（APR）将在给出有利意见的周年纪念日的30天内提交REC，并每年宣布该研究结束。
• 如果该研究过早结束，则首席研究人员将通知REC，包括过早终止的原因。
• 在研究结束后的一年内，首席研究人员将向Rec提交，其中包括任何出版物/摘要，包括任何出版物/摘要。

监管审查与合规性

• 这是一项单一中心研究
• 在任何站点可以将患者纳入研究之前，首席研究员/首席研究员或指定人员将确保获得参与组织的适当批准。
• 对于该研究的任何修正案，首席调查员或指定人员与赞助商达成协议，将向适当的机构提交信息，以便他们签发该修正案的批准。 首席调查员或指定人员将与网站（NHS站点的研发部门以及学习交付团队）合作，因此他们可以安排必要的安排来实施修正案，以确认他们对修订的研究的支持。