Zdraví střev u dětí s rakovinou

Akutní myeloidní leukémie (AML) je agresivní rakovina, která se vyskytuje v důsledku klonální expanze nezralých bílých krvinek, známých jako výbuchy (Chaudhury et al., 2018) s obecně špatnými výsledky ve srovnání s dětskou lymfoidní leukémií (Arad-Cohen et al., 2022). Zatímco úplná míra remise je vysoká u dětských AML při přibližně 90%, přežití bez událostí a celkové přežití zůstávají suboptimální při 45%a 65%, respektive 65%, po 3 letech a téměř polovina dětí se relapsu (Rasche et al., 2018). V poslední době došlo k posunu směrem k imunoterapii zaměřené na antigen při léčbě rakoviny, včetně AML, k vyvolání anti-leukamických odpovědí (Greiner, 2019).

Střevní mukozitida je jedním z nejčastějších vedlejších účinků chemoterapie, což je způsobeno narušením imunologické rovnováhy střevní slizniční bariéry (De Pietri et al., 2020). To má za následek změny absorpčních a sekrečních funkcí střevní sliznice, krvácení, střevní dysmotility nebo střevního selhání (McGrath, 2019; Ohta a kol., 2003). Předpokládá se, že chemoterapii indukovaná střevní mukozitida hraje ústřední roli ve vývoji systémového zánětu a infekcí (van der Velden et al., 2014). Klinické posouzení závažnosti střevní mukozitidy je zpochybněno nedostatkem validovaných bodovacích stupnic a objektivní biomarkery související s patogenezí mukozitidy pro posouzení jeho závažnosti jsou proto poptávají. Snížení hladin citrulinu v plazmě bylo spojeno se závažností střevního mukozitidy a systémového zánětu po transplantaci hematopoetických kmenových buněk u dospělých i dětí (Gosselin a kol., 2014; Van Vliet a kol., 2009).

Chemoterapii indukovaná střevní mukozitida způsobuje translokaci střevních bakterií a umožňuje bakteriím překročit poškozenou slizniční bariéru vedoucí k systémovému zánětu a potenciálně k systémovým infekcím, zejména u imunokompromitovaných pacientů (Villa a Sonis, 2015). Nemoci ovlivňující imunitní systém, jako je zánětlivé onemocnění střev (IBD), juvenilní idiopatická artritida (JIA) a akutní leukémie, jsou patologické podmínky ovlivňující pediatrickou populaci a jsou často spojeny se změnami ve střevní mikrobiotě, jako je pokles bakteriální rozmanitosti (Lucafò et al., 2020). Rostoucí důkazy naznačují, že střevní mikrobiota může interferovat s chemoterapeutickými a imunosupresivními léky, používanými při léčbě těchto onemocnění, snižování nebo usnadnění účinnosti léčiva (Peppas et al., 2023). Lidská střevní mikrobiota se skládá z několika stovek bakteriálních druhů [(Marchesi et al., 2016)]. Mikrobiální komunita střeva přináší významné přínosy pro fyziologii člověka na střevní epiteliální a systematické zánětlivé úrovni [(Kindon a kol., 2007; McDonnell a kol., 2021) (Feng et al., 2022)].

Strategie krmení v klinické praxi u pacientů s dětskou rakovinou s chemoterapií-indukovanou mukozitidou se liší značně, ale vždy vyžaduje střevní odpočinek a může vyžadovat parenterální (intravenózní) výživu (Kuiken a kol., 2017b) (Kuiken et al., 2017b). Parenterální výživa je spojena s významnými nepříznivými účinky, jmenovitě poškozením jater, rizikem infekcí, metabolickým porušováním, střevní atrofií, dysbiózou střevního mikrobiomu (Tume et al., 2020) je střevní mikrobiota nejhojnějším typem buněk prezentujících antigen. Je proto myslitelné, že parenterální výživa může hluboce změnit složení a funkci střevního mikrobiomu, což by mohlo vést k škodlivým účinkům na střevo (Pierre, 2017).

Katastrofický dopad diety o výložnosti vlákna na střevní mikrobiální rekolonizaci po kritické nemoci popsal Tanes et al, 2021, tým nastíní důležitost zavedení správné výživy po záchvatu nemoci (Tanes et al., 2021). Rozmanitost a relativní hojnost mikrobiálních metabolitů jsou silně závislé na specifických stravovacích složkách [(Morrison a Preston, 2016)]. Nekomplikovatelné dietní vlákno, jako jsou oligosacharidy a inulin, prokazují rezistenci vůči trávení v lidském tenkém střevě [(Lattimer a Haub, 2010)]. Ve velkém střevním dietním vlákně podléhá fermentaci mikrobiotou tlustého střeva za vzniku mastných kyselin s krátkým řetězcem (SCFA); acetát, butyrát a propionát, které působí jako primární zdroj energie uhlíku pro kolonocyty [5]. Synergický vztah mezi hostitelskými a střevními koncentracemi SCFA zahrnuje souběžné snížení luminálního pH, které samo o sobě inhibuje patogenní mikroorganismy a zvyšuje absorpci některých živin [(MacFarlane a MacFarlane, 2012)]. Kromě toho střevní SCFA řídí produkci T-Helperových buněk, protilátek a cytokinů a také se podílejí na udržování homeostázy slizničního systému [(Ríos-Covián a kol., 2016; Corrêa-oliveira et al., 2016)].

Terapie na bázi dietních a mikrobiomů jsou zkoumány pro potenciál podporovat zotavení zdravých populací střevních komensu během a po kritické nemoci. V pediatrické populaci roste zájem o používání smíšené stravy pro řízení nesnášenlivosti krmiv [(Schmitz é et al., 2021)]. Průmysl reagoval na tento posun v postupech krmení a vyvinul enterální vzorec s vysokým obsahem vlákna s přísadami odvozenými od potravin, u kterých bylo prokázáno, že zlepšuje toleranci enterálního krmiva [(O'Connor et al., 2022)].

Toto je první studie, která pozoruje dopad léčby AML na střevní mikrobiom dětí na různé způsoby krmení včetně parenterální výživy a vzorců na bázi potravin. Nakonec bude tato studie také pozorovat fázi zotavení střevní mikrobioty po ošetření AML a porovná se s následnými infekcemi a relapsem.

Případy: Děti s AML: Vzorky stolice budou získány ve třech předdefinovaných časových bodech pro analýzu mikrobiomu: výchozí zahájení léčby AML (do 2 týdnů od přijetí); Po indukční iniciaci chemoterapie (6-8 týdnů); Fáze obnovy 6-8 měsíců.

Pediatrické vzorky stolice budou shromažďovány pomocí soupravy pro sběr vzorků stolice. Každému účastníkovi bude poskytnuto 4 soupravy pro domácí sběr. Každá sada obsahuje:

• • Sběrná souprava Fe-Col®
• • Trubice sběru stolice (obsahující vyrovnávací paměť stability)
• • Biohazard taška
• • Taška Bubble Mailler
• • Pokyny.

Vzorky budou poté zveřejněny zpět do laboratoře Peplobio (Royal Mail Priority, Track24). Po příjezdu bude personál Peplobio pokračovat v příjmu vzorku, včetně ověření integrity vzorku a přistoupení. Vzorky budou homogenizovány a rozděleny na 200Ul alikvoty a uloženy po dobu až 7 dnů při -20 ° C.

Ovládací prvky: Vzorky ovládání zápasu budou odeslány do Peplobio pro analýzu mikrobiomu

Shrnutí testu:

Vzorky případu i ovládací stolice budou odeslány na nabídku Advanced Gut mikrobiomové nabídky Peplobio. Tento multiplexní test QPCR se zaměřuje na 16S gen pro 10 bakteriálních cílů. Tyto cíle budou konkrétně vybrány na základě klinických, recenzovaných korelačních studií, které implementují jejich zapojení do metabolických a zánětlivých onemocnění, jako je rakovina. Výsledky budou poskytovat absolutní kvantifikační údaje za pouhých 1-2 dny od příchodu vzorku do laboratoře.

Bioinformatické zpracování plánujeme sekvenovat oblast V4 bakteriálního genu 16S rRNA pomocí platformy Illumina Miseq podle specifikací výrobce. Čtení bude demultiplexována do souborů FastQ pro každý vzorek pomocí sekvenčních čárových kódů. Čtení dopředu a reverzní čtení budou spojeny s Pandaseq. Poté, co budou vyloučeny vzorky s méně než 3000 čteními. Připojené sekvenční soubory budou naformátovány pomocí skriptu Python pro přidání záhlaví Qiime s příslušným ID vzorku do každé sekvence před zhodnocení do jednoho souboru pro vstup do Qiime 1.8.0a.

Rozmanitost Shannon Alpha se vypočítá na tabulce nefiltrované biom pomocí alfa_diversity.py Skript a vážené vzdálenosti Unifrac byly vypočteny pomocí beta_diversity.py skript. Index mikrobiální dysbiózy (původně popsaný Gevers et al. Bude vypočítán v R pro každý vzorek. Index mikrobiální dysbiózy bude definován jako log10 celkové hojnosti v organismech se zvýšil v CD děleno celkovou hojností organismů sníženého v CD. Taxony zvětšené v CD zahrnují Enterobacteriaceae, Pasteurellaceae, Fusobacteriaceae, Neisseriaceae, Veillonellaceae a Gemellaceae. Snížené taxony v CD jsou bakteroidales, Clostridiales (s výjimkou Veillonellaceae), Erysipelotrichaceae a Bifidobacteriaceae

Analýza kompozice mikrobiomu:

Mikrobiální rozmanitost bude vyjádřena jako počet odlišných druhů v komunitě (bohatství), rovnoměrné rozdělení jejich hojnosti (vyrovnanosti) nebo kombinace obou aspektů, běžně nazývaných alfa rozmanitost. Mikrobiální diverzita alfa se odhaduje pomocí indexů Shannon a Simpson, zatímco mikrobiální bohatost se odhaduje pomocí indexu Chao1 nebo počtu pozorovaných druhů/operačních taxonomických jednotek (OTU).

Pro extrakci nukleových kyselin jsou vzorky lyžovány a nukleová kyselina extrahována pomocí soupravy pro izolaci nukleové kyseliny MAGMAX ™ Viral/Patogen II (MVP II), po IFU výrobce (Thermo Scientific). QRT-PCR bude prováděna pomocí primerů navržených pro 10 bakteriálních cílů (16S gen) a kvantitativní absolutní hojnost se stanoví pomocí metody standardní křivky.

Antropometrie (sběr dat: základní linie T0; T1 konec konsolidace 6-8měsíc; T2 regenerace 10-12 měsíců) Hmotnost bude stanovena na nejbližší 0,1 kg, přičemž subjekty oblečené v lehkém oblečení nebo oděv mezi pacienty pomocí modelu 880 elektronického měřítka (Seca, Hamburg, Německo). Výška bude měřena na nejbližší 0,1 cm bez ponožek nebo bot, za použití staniometru na stěně modelu 206 (SECA). Index tělesné hmotnosti (BMI) bude vypočítat pomocí standardního vzorce (KG M-2). Hmotnost a výška se měří podle standardních postupů. Index tělesné hmotnosti bude vypočítán jako hmotnost v kilogramech děleno výškou v metrech na druhou a BMI SDS bude získán z referenčních křivek WHO. Skóre BMI a standardních odchylek (SDS) budou vypočteny pomocí WHO jako referenčních dat.

Obezita bude potvrzena, když je percentil vyšší než 99,9. na křivce standardů růstu WHO, nebo Z-skóre byl vyšší než +3 (Cole et al., 2000). Děti starší než 5 let, s BMI mezi 85. a 97. percentily na křivce růstu dítěte WHO, budou klasifikovány jako nadváha a jako obézní, když je percentil vyšší než 97. nebo Z-skóre je vyšší než +2SD. Naopak, podváha bude potvrzena, když je Z-skóre nižší než -2SD střední obvod horní části ramene (MUAC), bude měřen na půli cesty mezi špičkou procesu akromionu a olecranonu s použitím nekvatitelného měřicího pásky 212 na nejbližší 0,1 cm sběr dat (sběr dat: T1 Konec konsolidace; Posoudit příjem potravy a enterální výživu dětí. Rodiče nebo pečovatelé budou poučeni o tom, jak zaznamenat spotřebu potravin a tekutin jejich dítěte pomocí opatření pro domácnost k odhadu velikosti porcí a typu potravin (včetně značek potravin, je -li to relevantní) do poskytnutého deníku. Dietní záznamy budou vedeny po dobu dvou všední dny a jeden víkendový den. Analýza příjmu stravy bude provedena pomocí softwaru Nutritics Nutriční analýzy (Dublin, Irská republika). Příjem energie a živin u dětí bude porovnán s pokyny SAGN 2017 (SACN, 2011).

Gastrointestinální snášenlivost (sběr dat: základní linie T0; T1 konec konsolidace 6-8měsíc; T2 regenerace 10-12 měsíců) Stolička konzistence je ústřední složkou popisu normálního nebo změněného zvyku střeva. Formulář stolice lze považovat za proxy opatření pro konzistenci stolice a odkazuje na tvar a zjevnou strukturu stolice, kterou lze vizuálně posoudit. Měřítka formy stolice jsou standardizovanou a levnou metodou klasifikace formy stolice do konečného počtu kategorií, které mohou zdravotničtí pracovníci a vědci použít.

Stupnice formy Bristol Stool Form je pořadová stupnice typů stolice od nejtěžší (typ 1) po nejjemnější (typ 7). Typy 1 a 2 jsou považovány za abnormálně tvrdé stolice (a ve spojení s jinými příznaky svědčícími o zácpě), zatímco typy 6 a 7 jsou považovány za abnormálně volné/kapalné stolice (a ve spojení s jinými příznaky svědčícími o průjmu). Typ 3, 4 a 5 jsou proto obecně považováni za nejvíce „normální“ formy stolice a jsou modální formy stolice v průřezových průzkumech zdravých dospělých. [22] Tolerance a podrobnosti o vzorcích stolice budou zaznamenány každý týden na úrovni oddělení a doma v závislosti na fázi léčby. Popisy nesnášenlivosti krmení budou zahrnovat zprávu o následujících proměnných: konzistence a objem stolice (počet stolic v 24hodinovém období), distenzi břicha, plyn, zvracení a celkovou úroveň pohodlí pacienta.

Další zdroje sběru dat:

Dopad chemoterapie

• Délka střevního mukozitidy
• Délka doba parenterální (intravenózní) výživy
• Délka doba na enterální výživu včetně nutričního složení vzorce
• Použití infekce a antibiotik
• Jakákoli jiná významná lékařská událost související s léčbou

Studijní nastavení Terciární hematologické centrum pro jedno centrum - Velká nemocnice Ormond Street. Vzorkování

Strategie analýzy dat Velikost vzorku Vypočítaná na primárním výsledku - Alfa Diverzita Primární výsledek Marker: Výpočty velikosti vzorku budou založeny na souvislosti mezi celkovou mikrobiální alfa -diverzitou (bohatost a vyrovnanost), aby zjistili rozdíl v rozmanitosti mezi kontrolou a účastníky po léčbě pro AML (konec indukce - 1 měsíce) za předpokladu, že je to, že je třeba po dodržení (25 na velikost), bude za předpokladu, že je za předpokladu, že je za předpokladu, že je to, že je třeba (25 na hodnotu) (25 na to, že je třeba, že je to celkem 50 sazebů). 0,82.

(Mattiello et al., 2016). Mikrobiální rozmanitost ve studiích klinických mikrobiomů: Velikost vzorku a statistické úvahy o výkonu (Gastrojournal.org)

25 dětí pro děti (1 vzorky stolice) 25 dětských případů (3 časové body = 75 vzorků stolice)

Asociace diverzity alfa se stavem kontroly případu budou testovány lineární a bezpodmínečnou logistickou regresí s úpravou věku a pohlaví. Složení mikrobioty (beta rozmanitost) bude porovnána neváženou a váženou analýzou UNIFRAC matice vzdálenosti s 10 000 permutacemi. Test Mann-Whitney U bude použit pro srovnání rozmanitosti a poměrů bakterií složek na úrovni rodu a druhů. Relativní hojnost mikrobů bude vyjádřena jako medián ± rozsah a Wilcoxon podepsaný rankový test bude použit pro porovnání alfa rozmanitosti pro případ vs. kontroly na začátku a 6 měsíců sledování a srovnání relativního hojnosti mezi výchozím a pozdějším časovým bodem. (Plaza-seazaz. et al., 2019).

Pro porovnání skupin byl použit test na hodnocení Wilcoxon Rank, zatímco k vyhodnocení složení mikrobioty na úrovni OTU a rodu byla použita permutační multivariační analýza rozptylu (permaneova).

Změny v diverzitě a složení mikrobioty během chemoterapie: lineární model smíšených efektů zkoumal změny v indexech rozmanitosti pomocí R verze 4.3.1. Pro změnu kompozice mikrobiomu bude použita negativní binomický regresní model smíšených efektů, hodnota P bude upravena pro míru falešného objevu metodou Benjamini-Hochberg a bude hlášena jako hodnota Q (Benjamini a Hochberg, 1995).

Normálnost bude zkontrolována pomocí testu Shapiro-Wilk v mince R (Hothorn et al., 2006). Neparametrické multivariační analýzy testů rozptylu budou prováděny funkcí Adonis, která bude nastavena na 9999 permutací. Data budou shrnuty podle jejich příslušného rozdělení. Pro parametrická data jsou uvedeny průměry ± SD (standardní odchylka) pro neparametrické proměnné, jsou uvedeny mediány ± IQR (rozsah mezi kvartilními). Pro všechny statistické analýzy bude hladina významnosti založena na hodnotě p ≤ 0,05.

Dopad základní mikrobioty na výsledky infekce pro počáteční stratifikaci rizika V době diagnózy AML bude Wilcoxon-Mann-Whitney test a logistická regrese použit k posouzení potenciálních rizikových faktorů pro následnou infekci, ke které dochází kdykoli během studijního období, včetně základního mikrobiomu. Pro každý taxon, jehož relativní hojnost se výrazně lišila u pacientů, kteří měli nebo neměli událost, bude RA dichotomizována při optimální mezní hodnotě založené na indexu Youden. Faktory s hodnotou p <0,1 v univariační analýze budou zkoumány vícenásobnou logistickou regresí. Kumulativní výskyt výsledků bude porovnán mezi rizikovými faktory se šedým testem.

7.3 Nábor Výzkumníci se každý den zúčastní kol Ward a prohlíží epické (elektronické poznámky) za účelem identifikace nového přijetí se všemi rodinami na úrovni oddělení na úrovni oddělení jejich dietology člena stávajícího týmu klinické péče o pacienta, který zkontroluje, zda splňují kritéria pro zařazení ve světle enterální trubkové krmení pro děti, které projevují známky intolerance krmiva. Počáteční přístup s pozváním a informačním listem účastníka jim bude poskytnut, který vysvětluje studii s podrobnostmi výzkumného týmu k projednání možností krmení ve studii 7.3.1 Souhlas s identifikací vzorku Popsaný informační list pro účastníky potenciálního účastníka doprovázený informačním listem: studie; jeho účel a povaha, co bude pro účastníka vyžadovat; jeho rizika a zátěž, návrhy a omezení protokolu; Známé vedlejší účinky a jakákoli rizika spojená s účastí. Bude jasně uvedeno, že účast je zcela dobrovolná, bude schopna učinit svobodnou volbu a účastník může ze studie kdykoli z jakéhokoli důvodu odstoupit, aniž by to ovlivnilo nebo ovlivnilo jejich péči, aniž by to ovlivnilo jejich práva, a bez nutnosti ospravedlnit stažení. To je jasně uvedeno v úvodních odstavcích PI.

Účastníkovi budou povoleny 3 dny, aby zvážil informace a šanci položit jakoukoli otázku na vyšetřovatele. Bude vyžadován a poté získán písemný informovaný souhlas od zástupce účastníka a osoba, která získala souhlas, musí být přiměřeně kvalifikovaná, zkušená a oprávněna tak učinit hlavní/hlavní vyšetřovatel.

Proces informovaného souhlasu /souhlasu Podepsaná kopie studie informovaná forma souhlasu /souhlasu bude poskytnuta právnímu zástupci účastníka a kopii lékařských záznamů účastníka. Originální podepsaný formulář bude ponechán na místě studie na bezpečném místě. Kompetentní dospělí (ve věku 16 let v době souhlasu) Po dokončení výše uvedeného pacienta poté podepíše a datuje dokument informovaného souhlasu. Osoba získaná souhlas i účastník musí osobně podepsat a datovat formulář. Kopie dokumentu informovaného souhlasu bude poskytnuta pacientovi pro jejich záznamy. Původní kopie bude podána do lékařských poznámek účastníka a další kopie podepsaného formuláře souhlasu bude podána do souboru webu vyšetřovatele. Jedna kopie formuláře souhlasu by měla být zaslána do YP (ve věku <16 let v době souhlasu) informovaný souhlas s mladým osobou mladší 16 let, poskytuje osoba s rodičovskou odpovědností nebo právním zástupcem.

Děti ve věku 6 let a vyšší budou osloveny k souhlasu, pokud tým klinické péče nepovažuje jinak, pak nebudou do studie vloženy, dokud nebude poskytnuto souhlas (kromě zákonného souhlasu příslušného dospělého) - výjimkou je výjimky, kde nezletilý vyjadřuje přání k rozhodnutí, které má být učiněno pouze příslušným dospělým.

Informační listy a formy souhlasu s věkem, které byly poskytnuty příznivým názorem, popisovaly (zjednodušené) podrobnosti o intervenci studie, studijních postupů a rizik budou k dispozici pro použití. YP by měl osobně napsat své jméno a datum na formulář ASSENT, který je poté podepsán rodičem/právním zástupcem a výzkumníkem.

Mladí lidé ve věku mladších 16 let, když se léčba původně začala a bude stará 16 let, budou ve studii znovu konzustováni pomocí specifických formulářů PI a formulářů souhlasu (pevné kopie) (tištěné kopie) formulářů budou nahrány do elektronických poznámek (EPIC) a tištěné kopie uložené v úřadu Dietetics během studie. Po uzavření studie budou formuláře souhlasu převedeny do výzkumu a vývoje dosahují úložiště dietetického výzkumu - roční poplatek 25 GBP, na něž se vztahuje dietetika.

Účastníci, kteří mohou mít potíže s adekvátním porozuměním angličtině, budou podporováni interpretační službou Gosh Trust. „TheBigword“ je jediným dodavatelem telefonního interpretace Trust, služba, která vám umožní pomoci každému klientovi, který může mít omezené dovednosti v anglickém jazyce. 0800 694 5093 Souhlas bude zaznamenán v elektronických poznámkách pacienta a ve studijních záznamech.

8 Etické a regulační úvahy Tento protokol a související dokumenty budou předloženy k etickému přezkumu integrovanému systému aplikací pro výzkum (IRAS) a úřadu pro výzkum zdraví (HRA).

Hodnocení a řízení rizika

8.1 Výbor pro etiku výzkumu (REC) a další regulační přezkum a zprávy

• Před zahájením studie bude vyhledán příznivý názor na rec
• Před začátkem studie bude vyhledáno schválení Úřadu pro výzkum zdravotnictví (HRA) a Health and Care Research Wales (HCRW) pro projektový výzkum v NHS v Anglii a Walesu.

Pro NHS Rec Recencovaný výzkum

• Podstatné změny, které vyžadují přezkum NHS REC a HRA, nebudou implementovány, dokud nebude tento přezkum zaveden a na místě nejsou zavedeny další mechanismy.
• Veškerá korespondence s REC a HRA bude zachována.
• Je odpovědností hlavního vyšetřovatele předkládat výroční zprávy podle potřeby.
• Hlavní vyšetřovatel oznámí rec o konci studie.
• Roční zpráva o pokroku (APR) bude předložena do 30 dnů od data výročí, kdy byl příznivý názor vydán, a každoročně, dokud nebude studie vyhlášena.
• Pokud je studie ukončena předčasně, hlavní vyšetřovatel oznámí REC, včetně důvodů předčasného ukončení.
• Do jednoho roku po skončení studie předloží hlavní vyšetřovatel závěrečnou zprávu s výsledky, včetně jakýchkoli publikací/abstraktů, Rec.

Regulační přehled a dodržování předpisů

• Toto je studie s jedním centrem
• Než se do studie může do studie zaregistrovat jakékoli místo, hlavní vyšetřovatel/hlavní vyšetřovatel nebo zástupce zajistí, aby byla zavedena příslušná schválení zúčastněných organizací.
• Pro jakoukoli změnu studie bude hlavní vyšetřovatel nebo navrhovatel v souladu se sponzorem předložit informace příslušného orgánu, aby jim mohl vydat schválení pozměňovacího návrhu. Hlavní vyšetřovatel nebo navrhovatel bude spolupracovat s weby (oddělení výzkumu a vývoje na webech NHS i v týmu doručování studií), aby mohli zavést nezbytná opatření k provedení pozměňovacího návrhu, aby potvrdila jejich podporu pro studii ve znění.