Alogenní terapie mezenchymálními kmenovými buňkami odvozená z kostní dřeně v případech hemofilie

Hemofilie A je X-vázaná krvácivá porucha způsobená nedostatkem nebo abnormalitou faktoru VIII. Jde o nejčastější dědičný deficit koagulačního proteinu s incidencí přibližně 1 z 10 000 mužů. Více než 75 % hemofilických pacientů trpí závažným typem onemocnění.

Léčba hemofilie je ve vyspělých zemích snadno dostupná; odhaduje se však, že 70 % lidí s tímto onemocněním na celém světě není diagnostikováno nebo nedostatečně léčeno. Kromě toho se asi u 20 % pacientů s hemofilií A vyvinou inhibitory léčby, a proto je obtížné je léčit.

Exogenní náhrada faktoru 8 u pacientů s hemofilií představuje velkou finanční a lékařskou výzvu. Optimální terapeutickou možností pro tyto pacienty je zajištění endogenní sekrece faktoru. To bylo navrženo prostřednictvím transplantace jater. Transplantace jater u lidské a psí hemofilie A má za následek zvýšení hladin faktoru VIII na normální hodnoty a tím vyléčí krvácivou diatézu. Vzhledem k problémům s dostupností dárců, hlavním operačním zákroku a potřebě celoživotní imunosuprese byla jako slibná možnost léčby poruch srážlivosti navržena buněčná terapie s použitím izolovaných hepatocytů. Byla prokázána terapeutická účinnost lidských hepatocytů transplantovaných pod pouzdra ledvin myší. Transplantace potkanů ​​divokého typu s nedostatečnou konjugací bilirubinu po ischemickém/reperfuzním poškození vedla k 30% poklesu sérového bilirubinu, výskytu konjugátů bilirubinu ve žluči a expresi normálního enzymu glukuronyltransferázy, což znamená, že transplantace malého počtu hepatocytů může vést k částečná náprava funkčních vad.

Přestože buněčná transplantace hepatocytů řeší operační riziko, má nevýhodu v obtížné propagaci hepatocytů in vitro.

Alternativou k transplantaci hepatocytů je použití in vitro transdiferencovaných kmenových buněk z kostní dřeně.

V posledních několika letech byla mnohými výzkumníky navržena nová možnost regenerace poškozených jater z buněk získaných z kostní dřeně. Studie ukázaly, že buňky kostní dřeně se nejen diferencovaly na jaterní a jaterní sinusoidní endoteliální buňky, ale také exprimovaly intaktní gen domény FVIII A3.

Mezenchymální kmenové buňky mají mnoho výhod jako kandidáti pro buněčnou terapii. Mohou se množit in vitro, nevyvolávají imunitní reakci, protože exprimují pouze lidský leukocytární antigen (HLA)-G, a bylo prokázáno, že in vitro přijímají fenotyp hepatocytů.

U pacientů s hemofilií A je matka přenašečkou, otec je zcela normální a sourozenci ženy mají 50% šanci, že budou normální nebo přenašeči. Existuje tedy možnost nalezení dárce shodného s HLA s normální aktivitou FVIII v rodině. Použití mezenchymálních kmenových buněk (BM-MSC) má oproti BM-HSC následující výhody:

1. MSC se mohou diferencovat jak na jaterní, tak na endoteliální fenotypy
2. MSC neexprimují HLA antigeny kromě HLA-G, který způsobil imunosupresi, takže párování pro transplantaci MSC může být jednodušší.

Hypotézou této studie je použití alogenních mezenchymálních kmenových buněk získaných z kostní dřeně indukovaných k přijetí fenotypu hepatocytů in vitro jako produktu buněčné terapie u pacientů s hemofilií.

Dárci budou vystaveni:

1. Aspirace kostní dřeně v lokální nebo krátké celkové anestezii, 40-60ml BM bude odebráno do heparinizovaných stříkaček.
2. Frakce mononukleárních buněk bude separována pomocí stroje SEPAX (Biosafe)
3. MSC budou izolovány pomocí plastické adherence a podrobeny hepatické indukci s použitím sekvenčního fibroblastového růstového faktoru a přidání hepatocytového růstového faktoru za podmínek GMP.
4. Ověření jaterní indukce bude provedeno pomocí morfologického, molekulárního a proteomického screeningu.
5. Buňky pak budou sklizeny s použitím 0,25% trypsinu, promyty a suspendovány ve sterilním fyziologickém roztoku v dávce 2 miliony buněk na kg tělesné hmotnosti v konečném objemu 5 ml a injikovány do jaterního parenchymu za sonografického monitorování.