Vliv PTFE-d bariéry záměrně vystavené bukálnímu prostředí při řízené regeneraci kosti k ochraně hřebene

Design studie Tato klinicko-laboratorní, paralelní, randomizovaná, prospektivní a kontrolovaná studie bude určovat vliv PTFE-d bariéry záměrně vystavené bukálnímu prostředí při řízené kostní regeneraci na uchování hřebene pomocí mikrobiologických, radiografických, na pacienta zaměřených výsledků, molekulárních vzor kostních markerů a stabilizace implantátu.

Experimentální skupiny

Po lokální anestezii byla provedena intrasulkulární incize kolem zubu, který měl být extrahován, a byla oddělena mukoperiostální chlopeň pro adekvátní obnažení 3 mm alveolárního hřebene přilehlého k alveolu. Poté byly minimálně invazivním způsobem provedeny výkony pro dislokaci a odstranění zubů, v případě potřeby s použitím periotomů, pák a extraktorů. Následně byla provedena irigace fyziologickým roztokem a poté pomocí specifického softwaru budou pacienti náhodně rozděleni do jedné z následujících léčeb:

GBR Group: Po extrakci byla membrána PTFE-d (CytoplastTM Ti-250 Titanium-Reinforced, Přední úzká 12 mm x 24 mm, Osteogenics, Lubbock, TX, USA) přizpůsobena nůžkami a upravena přes objímku, přesahující tři milimetry od jeho okraje. Poté byla membrána vložena subperiostálně pod bukální a palatinální chlopně pomocí Molt odlepovače. Pro stabilizaci membrány, která byla záměrně vystavena orálnímu prostředí, byl proveden minimální odraz chlopní. Před sešitím byla potvrzena pasivní stabilita membrány nad alveolem a také absence záhybů či vrásek v membráně. K chlopním se poté přistoupilo v předextrakční poloze a sešily se zkříženými stehy s cílem zvýšit stabilitu membrány závitem PTFE 4-0 (Cytoplast PTFE, CS0618PREM, Osteogenics, Lubbock, TX, USA).

Non-GBR skupina: Po extrakci nebyla provedena žádná další léčba. Chlopně byly poté přemístěny a sešity nylonovou nití 5,0 (Ethicon, Jonhson's Jonhson, São José dos Campos).

Dočasné adhezivní protézy přizpůsobené sousedním zubům byly instalovány a udržovány až do okamžiku zavedení implantátu. Kontrola supragingiválního biofilmu byla prováděna ústními vodami 0,12% chlorhexidinu po dobu 4 týdnů u všech experimentálních skupin. Byla indikována předoperační protizánětlivá léčba (dexametazon 4 mg, jednorázová dávka, 1 hodinu před výkonem) a pooperační analgetika (dipyron sodný 500 mg, každé 4 hodiny, po dobu 3 dnů). Pacienti byli instruováni, aby užívali analgetika pouze v případě bolesti během výše popsaného období, přičemž byli instruováni, aby zaznamenávali množství požitých léků. Profylaktická systémová antimikrobiální terapie byla provedena 1 hodinu před chirurgickým výkonem 2 gramy amoxicilinu a stejná medikace bude předepsána po dobu 7 dnů v pooperačním období, 500 mg každých 8 hodin.

Stehy byly odstraněny po 15 dnech. Ve skupině GBR byla membrána odstraněna po 28 dnech v anestezii (Hoffmann et al. 2007, Carbonell et al. 2014, Cheon et al. 2017), přičemž byla opatrně odstraněna tahovým pohybem pomocí pinzeta.

Všichni pacienti byli sledováni měsíčně, po celou dobu studie, aby byla dodržována periodontální údržba a zpřísněny hygienické pokyny.

Umístění implantátů a protéz Tři měsíce po extrakci, bez ohledu na experimentální skupinu, dostali pacienti zubní implantáty. Proto byly vytvarovány pro plánování rehabilitace a byly vyrobeny chirurgické návody pro použití při operaci zavedení implantátu. Při chirurgickém zákroku byli pacienti podrobeni lokální anestezii a byly vytvořeny mukoperiostální laloky pro přístup a adekvátní obnažení alveolární kosti. Poté bylo provedeno vrtání pro vložení implantátů. V obou skupinách byly provedeny jednostupňové implantáty s okamžitým umístěním provizorních protéz na implantáty. Všechny operace byly provedeny stejným operátorem (EKM).

Po experimentální fázi studie byly instalovány definitivní protézy. Stehy chirurgických zákroků byly provedeny nylonovou nití 5,0 (Ethicon, Jonhson's Jonhson, São José dos Campos) a ta byla odstraněna po 7 dnech. Kontrola supragingiválního biofilmu byla prováděna ústními vodami 0,12% chlorhexidinu po dobu 7 dnů po operaci. Byla indikována předoperační protizánětlivá terapie (dexamethason 4 mg, jednorázová dávka, 1 hodinu před výkonem) a pooperační analgetika (dipyron sodný 500 mg, každé 4 hodiny, po 2 dny).

Klinické vyšetření Stejný zkoušející (SB) provedl všechna klinická měření. K provedení kalibrace uvnitř vyšetřujícího bylo vybráno 15 nestudovaných jedinců s dentálními implantáty. Vyšetřující změřil hloubku sondování periimplantátu u všech jedinců dvakrát během 24 hodin. Vnitrotřídní korelace byla vypočtena jako 95% reprodukovatelnost.

Pomocí sondy North Carolina/Colorvue (Hu-Friedy, Chicago, IL, USA) byly měřeny následující parametry na čtyřech místech zubních implantátů zahrnutých do studie na začátku studie (před extrakcí a GBR) a po 3 měsících sledování- nahoru: Hloubka sondy (PPD/mm), což byla vzdálenost od spodní části periodontálního sulku/kapsy k periodontálnímu okraji; Clinical Attachment Level (CAL/mm), což byla vzdálenost od spoje cementové skloviny ke dnu periodontální kapsy.

Hodnocení mikrobiomu Mikrobiologická hodnocení biofilmu přítomného na bariérách (skupina GBR) a v oblasti opravy (skupina mimo GBR) byla provedena po 3 dnech extrakce a po 28 dnech (v době odstranění bariéry ve skupině GBR ).

Mikrobiologická analýza bude provedena pomocí sekvenační techniky genu 16S na platformě Illumina HiSeq, která umožňuje určit diverzitu a početnost mikrobiální populace ve stejném vzorku. Toto hodnocení bude provedeno v Centralizované víceuživatelské laboratoři funkční genomiky.

Hodnocení parametrů udávaných pacientem Hodnocení parametrů zaměřených na pacienta týkajících se symptomů souvisejících s morbiditou a kvalitou života v pooperačním období bude provedeno po 3, 7, 14, 28, 35 a 42 dnech extrakce pomocí dotazníků , na základě vodorovné čáry 100 mm (vizuální analogová stupnice; VAS).

Molekulární hodnocení markerů souvisejících s osteoklasty / blastogenezí Při chirurgickém zákroku při zavádění dentálních implantátů bude při frézování pro přípravu lůžka odebrána kostní tkáň pomocí jednorázového kostního sběrače přizpůsobeného vakuové pumpě / chirurgické odsávačce. Část vzorku kostní tkáně bude použita pro analýzu genové exprese a další část pro imunoenzymatickou analýzu různých biomarkerů souvisejících s osteoklasty / blastogenezí. Všechny molekulární analýzy týkající se markerů osteoklastů / blastogeneze budou prováděny v Dental Research Laboratory ústředí instituce. Všechny odebrané biopsie budou uloženy ve specifickém roztoku, aby se zabránilo degradaci RNA (RNAlater®, Ambion Inc., Austin, TX).

Analýza genové exprese Extrakce RNA: Odebrané tkáně budou řádně zabaleny do roztoku, aby se zabránilo degradaci RNA (RNAlater®, Ambion Inc., Austin, TX). Celková RNA bude izolována reagenční metodou TRIZOL (Gibco BRL, Life Technologies, Rockville, MD, USA). Nejprve se odsaje roztok RNAlater a rozdrcený vzorek se poté umístí do činidla TRIZOL, protřepává se po dobu 30 sekund a inkubuje se 5 minut při pokojové teplotě. Po této době se přidá chloroform (Sigma, St. Louis, MO, USA), směs se míchá a odstřeďuje při 10 000 ot./min po dobu 15 minut při teplotě 4oC. Vodná část se přenese do jiné zkumavky, do které se přidá isopropanol, protřepe, inkubuje 20 minut při teplotě -20 °C a odstředí stejným způsobem, jak je popsáno výše. Po tomto procesu se vytvoří peleta, která se promyje vychlazeným 75% ethanolem a suší při pokojové teplotě. Vzorky RNA budou resuspendovány v přibližně 50 ul vody ošetřené diethylpyrokarbonátem (DEPC) a skladovány při -70oC. Koncentrace RNA bude stanovena pomocí spektrofotometru.

Bude provedeno ošetření DNAázou a provede se Real-time PCR (RT-PCR). Primery pro GAPDH (referenční gen), transformující růstový faktor (TGF-β), kostní sialoprotein (BSP) a kolagen typu I (COL-I ) bude navržena pomocí pGBRram vyvinutého speciálně pro návrh primerů pro LightCycler (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Německo). Všechny primery budou zkontrolovány na specificitu kontrolou křivky tání pomocí pozitivních a negativních kontrol. Reakční profil bude určen podle vzorce navrženého výrobcem zařízení. Pro každý z "běhů" bude použita voda jako negativní kontrola a produkt reakcí bude kvantifikován pomocí vlastního pGBRram výrobce (LightCycler Relative Quantification Software - Roche Diagnostics GmbH). GAPDH bude použit jako referenční gen (housekeeping) pro normalizaci hodnot.

Imunoenzymatická analýza Část vzorku kostní tkáně odebraná v době zavedení implantátu bude umístěna do sterilních zkumavek obsahujících 400 μl fosfátem pufrovaného fyziologického roztoku (PBS) s 0,05 % Tween-20. Všechny vzorky budou skladovány při -20 °C. Poté se tkáň zváží, homogenizuje a rozpustí v PBS na konečnou koncentraci 100 mg tkáně/ml. Po míchání ve Vortexu po dobu 10 minut bude každý vzorek centrifugován při 370 g po dobu 5 minut, supernatant bude odebrán a uložen při -70 °C až do použití. Aby se zabránilo proteázové aktivitě, bude celý postup prováděn při 4 °C. Dickkopf (DKK1), Sklerostin (SOST), Tumor nekrotizující faktor (TNF-α), Osteoprotegerin (OPG), Osteokalcin (OC), Osteopontin (OPN) ( HBNMAG-51K, Millipore Corporation, Billerica, MA, USA), receptor aktivátoru vazby NF-KB (RANKL) (HRNKLMAG-31K-01, Millipore Corporation, Billerica, MA, USA), osteonektin (OSN) a tartrát rezistentní kyselá fosfatáza ( TRAP) (HCMBMAG-22K, Millipore Corporation, Billerica, MA, USA), bude stanovena pomocí technologie Luminex / MAGpix, která umožňuje určit přítomnost a absolutním způsobem kvantifikovat koncentraci různých markerů ve stejném vzorku.

Za tímto účelem budou analýzy prováděny na 96-jamkových destičkách s pomocí výše zmíněných panelů s vysokou citlivostí podle pokynů výrobce. Vzorky budou vyhodnoceny duplicitně a průměr získaných hodnot bude použit pro stanovení vypočítat koncentrace každého markeru.

Tomografická analýza CT skeny pacientů budou získány ihned po extrakci a 3 měsíce později (před zavedením implantátu). Tomografická vyšetření provedená v různých obdobích budou analyzována na míru ztráty kostní hmoty po extrakci a konzervaci lůžka, jak vertikálně, tak horizontálně, pomocí softwaru Dental Slice.