Impatto della barriera in PTFE-d esposta intenzionalmente all'ambiente bucale nella rigenerazione ossea guidata alla conservazione della cresta

Disegno dello studio Questo studio clinico-laboratorio, parallelo, randomizzato, prospettico e controllato determinerà l'impatto della barriera PTFE-d intenzionalmente esposta all'ambiente bucale nella rigenerazione ossea guidata alla conservazione della cresta, utilizzando risultati microbiologici, radiografici, centrati sul paziente, molecolari pattern di marker relativi all'osso e stabilizzazione dell'impianto.

Gruppi sperimentali

Dopo l'anestesia locale, è stata praticata un'incisione intrasulculare intorno al dente da estrarre ed è stato staccato un lembo mucoperiosteo per un'adeguata esposizione di 3 mm della cresta alveolare adiacente all'alveolo. Successivamente, sono state eseguite procedure di lussazione e rimozione dentale in modo minimamente invasivo, utilizzando periotomi, leve ed estrattori, se necessario. Successivamente, è stata eseguita l'irrigazione con soluzione fisiologica e poi, utilizzando un software specifico, i pazienti saranno assegnati in modo casuale a ricevere uno dei seguenti trattamenti:

GBR Group: dopo l'estrazione, la membrana in PTFE-d (CytoplastTM Ti-250 Titanium-Reinforced, Anterior Narrow 12 mm x 24 mm, Osteogenics, Lubbock, TX, USA) è stata personalizzata con le forbici e regolata sopra l'alveolo, superando i tre millimetri da suoi margini. Quindi, la membrana è stata inserita sottoperiostalmente sotto i lembi vestibolari e palatali con l'ausilio del distaccatore Molt. È stata eseguita una riflessione minima del lembo per stabilizzare la membrana, che è stata mantenuta intenzionalmente esposta all'ambiente orale. Prima della sutura è stata confermata la stabilità passiva della membrana sopra l'alveolo, così come l'assenza di pieghe o grinze nella membrana. I lembi sono stati quindi avvicinati nella posizione di pre-estrazione e suturati con punti incrociati, con l'obiettivo di aumentare la stabilità della membrana, con filo PTFE 4-0 (Cytoplast PTFE, CS0618PREM, Osteogenics, Lubbock, TX, USA).

Gruppo non GBR: dopo l'estrazione, non è stato eseguito alcun ulteriore trattamento. I lembi sono stati quindi riposizionati e suturati con filo di nylon 5.0 (Ethicon, Jonhson's Jonhson, São José dos Campos).

Sono state installate e mantenute fino al momento dell'inserimento dell'impianto protesi provvisorie adesive adattate ai denti adiacenti. Il controllo del biofilm sopragengivale è stato eseguito con collutori di clorexidina allo 0,12% per un periodo di 4 settimane in tutti i gruppi sperimentali. Sono state indicate la terapia antinfiammatoria pre-chirurgica (desametasone 4 mg, dose singola, 1 ora prima della procedura) e gli analgesici postoperatori (dipirone sodico 500 mg, ogni 4 ore, per 3 giorni). I pazienti sono stati istruiti ad assumere farmaci analgesici solo in caso di dolore durante il periodo sopra descritto, essendo istruiti a registrare la quantità di farmaci ingeriti. La terapia profilattica antimicrobica sistemica è stata eseguita 1 ora prima dell'intervento chirurgico con 2 grammi di Amoxicillina e lo stesso farmaco sarà prescritto per 7 giorni nel periodo postoperatorio, 500 mg ogni 8 ore.

Le suture sono state rimosse dopo 15 giorni. Nel gruppo GBR, la membrana è stata rimossa dopo il periodo di 28 giorni, in anestesia (Hoffmann et al. 2007, Carbonell et al. 2014, Cheon et al. 2017), rimossa delicatamente con il movimento di trazione con l'ausilio di un pinzette.

Tutti i pazienti sono stati monitorati mensilmente, durante tutto il periodo di studio, per osservare la manutenzione parodontale e rafforzare le istruzioni igieniche.

Inserimento di impianti e protesi Tre mesi dopo l'estrazione, indipendentemente dal gruppo sperimentale, i pazienti hanno ricevuto impianti dentali. Pertanto, sono stati modellati per la pianificazione della riabilitazione e sono state realizzate guide chirurgiche da utilizzare nella chirurgia di posizionamento degli impianti. Nella procedura chirurgica, i pazienti sono stati sottoposti ad anestesia locale e sono stati realizzati lembi mucoperiostei per l'accesso e l'adeguata esposizione dell'osso alveolare. Successivamente, è stata eseguita la perforazione per inserire gli impianti. In entrambi i gruppi sono stati eseguiti impianti in un'unica fase, con posizionamento immediato di protesi provvisorie su impianti. Tutti gli interventi chirurgici sono stati eseguiti dallo stesso operatore (EKM).

Dopo la fase sperimentale dello studio, sono state installate le protesi definitive. Le suture delle procedure chirurgiche sono state eseguite con filo di nylon 5.0 (Ethicon, Jonhson's Jonhson, São José dos Campos) ed è stato rimosso dopo 7 giorni. Il controllo del biofilm sopragengivale è stato eseguito con collutori di clorexidina allo 0,12% per un periodo di 7 giorni dopo l'intervento. Sono state indicate la terapia antinfiammatoria pre-chirurgica (desametasone 4 mg, dose singola, 1 ora prima della procedura) e gli analgesici postoperatori (dipirone sodico 500 mg, ogni 4 ore, per 2 giorni).

Esame clinico Lo stesso esaminatore (SB) ha eseguito tutte le misurazioni cliniche. Per eseguire la calibrazione intra-esaminatore, sono stati scelti 15 soggetti non partecipanti allo studio che presentavano impianti dentali. L'esaminatore ha misurato la profondità di sondaggio perimplantare di tutti gli individui due volte nell'arco di 24 ore. La correlazione intra-classe è stata calcolata come riproducibilità del 95%.

Utilizzando una sonda North Carolina/Colorvue (Hu-Friedy, Chicago, IL, USA), i seguenti parametri sono stati misurati in quattro siti degli impianti dentali inclusi nello studio al basale (prima dell'estrazione e GBR) e a 3 mesi di follow- in alto: profondità di sondaggio (PPD/mm), ovvero la distanza dal fondo del solco/tasca parodontale al margine parodontale; Livello di attacco clinico (CAL/mm), che era la distanza dalla giunzione smalto-cemento al fondo della tasca parodontale.

Valutazione del microbioma Le valutazioni microbiologiche del biofilm presente sulle barriere (Gruppo GBR) e nell'area di riparazione (Gruppo non GBR) sono state effettuate dopo 3 giorni dall'estrazione e dopo 28 giorni (al momento della rimozione della barriera nel gruppo GBR ).

L'analisi microbiologica sarà effettuata mediante la tecnica di sequenziamento del gene 16S mediante la piattaforma Illumina HiSeq, che consente di determinare la diversità e l'abbondanza della popolazione microbica nello stesso campione. Questa valutazione sarà effettuata presso il Laboratorio Multiutenza Centralizzato di Genomica Funzionale.

Valutazione dei parametri riferiti dal paziente La valutazione dei parametri centrati sul paziente relativi ai sintomi relativi alla morbilità e alla qualità della vita nel periodo postoperatorio verrà effettuata dopo 3, 7, 14, 28, 35 e 42 giorni dall'estrazione, utilizzando questionari , basato su una linea orizzontale di 100 mm (Visual Analog Scale; VAS).

Valutazione molecolare dei marcatori relativi all'osteoclasto/blastogenesi Nella procedura chirurgica per l'inserimento di impianti dentali, durante la fresatura per preparare il letto, il tessuto osseo verrà rimosso utilizzando un raccoglitore osseo monouso adattato alla pompa del vuoto/aspiratore chirurgico. Una parte del campione di tessuto osseo verrà utilizzata per l'analisi dell'espressione genica e un'altra parte per l'analisi immunoenzimatica di diversi biomarcatori correlati all'osteoclasto/blastogenesi. Tutte le analisi molecolari relative ai marcatori di osteoclasti/blastogenesi saranno eseguite presso il Laboratorio di Ricerca Odontoiatrica dell'Ente Sede. Tutte le biopsie raccolte verranno conservate in una soluzione specifica per evitare la degradazione dell'RNA (RNAlater®, Ambion Inc., Austin, TX).

Analisi dell'espressione genica Estrazione dell'RNA: i tessuti rimossi saranno adeguatamente imballati in una soluzione per evitare la degradazione dell'RNA (RNAlater®, Ambion Inc., Austin, TX). L'RNA totale sarà isolato con il metodo del reagente TRIZOL (Gibco BRL, Life Technologies, Rockville, MD, USA). In primo luogo, la soluzione di RNAlater verrà aspirata e il campione frantumato verrà quindi posto nel reagente TRIZOL, agitato per 30 secondi e incubato per 5 minuti a temperatura ambiente. Dopo questo periodo, verrà aggiunto cloroformio (Sigma, St. Louis, MO, USA), agitato e centrifugato a 10.000 rpm per 15 minuti ad una temperatura di 4°C. La porzione acquosa verrà trasferita in un'altra provetta a cui verrà aggiunto isopropanolo, agitata, incubata per 20 minuti a una temperatura di -20°C e centrifugata nello stesso modo descritto sopra. Dopo questo processo si formerà un pellet, che sarà lavato con etanolo al 75% raffreddato ed essiccato a temperatura ambiente. I campioni di RNA saranno risospesi in circa 50µl di acqua trattata con dietilpirocarbonato (DEPC) e conservati a -70oC. La concentrazione di RNA sarà determinata utilizzando uno spettrofotometro.

Verrà eseguito il trattamento con DNAasi e verrà condotta la PCR in tempo reale (RT-PCR). Primer per GAPDH (gene di riferimento), fattore di crescita trasformante (TGF-β), scialoproteina ossea (BSP) e collagene di tipo I (COL-I ) sarà progettato con l'ausilio di un pGBRram sviluppato appositamente per progettare primer per LightCycler (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germania). Tutti i primer saranno controllati per la specificità controllando la curva di Melting usando controlli positivi e negativi. Il profilo di reazione sarà determinato secondo la formula suggerita dal produttore dell'apparecchiatura. Per ciascuna delle "corse", l'acqua verrà utilizzata come controllo negativo e il prodotto delle reazioni sarà quantificato utilizzando il pGBRram del produttore (Software di quantificazione relativa LightCycler - Roche Diagnostics GmbH). GAPDH sarà utilizzato come gene di riferimento (housekeeping) per la normalizzazione dei valori.

Analisi immunoenzimatica Parte del campione di tessuto osseo raccolto al momento dell'inserimento dell'impianto sarà posto in provette sterili contenenti 400 μL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) con Tween-20 allo 0,05%. Tutti i campioni saranno conservati a -20°C. Quindi, il tessuto sarà pesato, omogeneizzato e disciolto in PBS ad una concentrazione finale di 100mg di tessuto/mL. Dopo aver agitato in Vortex per 10 minuti, ogni campione sarà centrifugato a 370g per 5 minuti, il surnatante sarà raccolto e conservato a -70°C fino all'utilizzo. Per evitare l'attività della proteasi, l'intera procedura verrà eseguita a 4 ° C. Dickkopf (DKK1), Sclerostina (SOST), Fattore di necrosi tumorale (TNF-α), Osteoprotegerina (OPG), Osteocalcina (OC), Osteopontina (OPN) ( HBNMAG-51K, Millipore Corporation, Billerica, MA, USA), recettore dell'attivatore di legame NF-κB (RANKL) (HRNKLMAG-31K-01, Millipore Corporation, Billerica, MA, USA), Osteonectina (OSN) e fosfatasi acida resistente al tartrato ( TRAP) (HCMBMAG-22K, Millipore Corporation, Billerica, MA, USA), sarà determinato utilizzando la tecnologia Luminex / MAGpix, che consente di determinare la presenza e quantificare in modo assoluto la concentrazione di diversi marcatori nello stesso campione.

A tale scopo, le analisi verranno eseguite in piastre da 96 pozzetti, con l'ausilio dei pannelli ad alta sensibilità sopra menzionati, seguendo le istruzioni del produttore. I campioni saranno valutati in doppio e la media dei valori ottenuti sarà utilizzata per calcolare le concentrazioni di ciascun marcatore.

Analisi tomografica Le scansioni TC dei pazienti saranno ottenute immediatamente dopo l'estrazione e 3 mesi dopo (prima del posizionamento dell'impianto). Gli esami tomografici eseguiti nei diversi periodi saranno analizzati per il tasso di perdita ossea dopo l'estrazione e la conservazione dell'alveolo, sia verticalmente che orizzontalmente, attraverso il software Dental Slice.