Společná transplantace exozomů odvozených z mezenchymálních kmenových buněk a autologních mitochondrií pro pacienty kandidáty na operaci CABG

Tento výzkum bude proveden jako retrospektivní kohortová studie v Teheránském srdečním centru. Pacienti budou vybráni z kandidátů na CABG s výrazně nízkou ejekční frakcí stanovenou tečkovanou echokardiografií. Pacienti se závažnými komorbiditami nebo poškozením mozku budou ze studie vyloučeni. Od pacientů bude odebrán podrobný informovaný souhlas. Pacienti, kteří odmítnou poskytnout souhlas, dostanou standardní léčbu.

Kritéria

Kritéria pro zařazení:

• Pacienti, kteří jsou kandidáty na CABG kvůli CAD±MR
• Historie Q-vlny MI, méně než jeden měsíc
• Věk: 35-80
• LVEF
• Studie životaschopnosti, jak bylo prokázáno zátěžovým echokardiogramem s nízkou dávkou dobutaminu a/nebo jadernou studií redistribuce thalia (alespoň čtyři životaschopné segmenty).

Kritéria vyloučení:

• Závažná přidružená onemocnění (například selhání ledvin, selhání jater atd.)
• Neschopnost poskytnout informovaný souhlas

• Poškození mozku

  1. Studijní skupiny:

     Standardní léčbou prováděnou u všech pacientů je revaskularizace bypassem koronární tepny. Pacienti budou rozděleni do čtyř skupin na základě přijaté léčby, navíc ke standardní léčbě.

     Transplantace mitochondrií a exozomů intrakoronární a intramyokardiální injekcí. Studijní skupiny:

     1. Intrakoronární a intramyokardiální injekce exozomů (5 pacientů)
     2. Intrakoronární a intramyokardiální injekce mitochondrií (5 pacientů)
     3. Intrakoronární a intramyokardiální injekce exozomů a mitochondrií (5 pacientů)
     4. Placebo (5 pacientů) U pacientů ve skupinách b a c budou mitochondrie extrahovány ze vzorku svalové tkáně extrahované na začátku operace z prsních svalů obnažených po sternotomii. Současně s operací budou ze svalového vzorku extrahovány mitochondrie. Když je revaskularizace dosaženo bypassovými štěpy, extrahované mitochondrie budou injikovány do srdečního svalu. Inzulínová stříkačka o průměru 31 bude provádět injekce do deseti různých míst v ischemické oblasti srdečního svalu. Kromě přímé injekce do srdečního svalu bude jedna třetina extrahovaných mitochondrií injikována do koronárního sinu.

     Pacienti ve skupinách aab obdrží extrahovaný exosom z buněk MSC popsaný v kroku 2. Extrahovaný exozom bude injikován do koronárního sinu po umístění kardiopulmonálního bypassu.

  2. Izolace a charakterizace mezenchymálních kmenových buněk z lidské pupeční šňůry (UC-MSC) Lidské mezenchymální kmenové buňky z pupeční šňůry jsou enzymaticky izolovány kolagenázou ve smyslu předchozí studie a kultivovány v médiu DMEM / F12 s 10% FBS zbaveným exosomů (GMP stupně) s penicilinovými a streptomycinovými antibiotiky a inkubovány při 37 °C a 5 % CO2. Poté, co konfluence buněk dosáhne 80 %, se shromáždí upravené médium (pro izolaci exosomů se buňky použijí v pasáži 3).

     Fenotypová analýza se provádí na třetí pasáži. Povrchové antigeny jsou analyzovány na CD90, CD105, CD73 a CD34 pomocí průtokové cytometrie.

  3. Extrakce exosomů z UC-MSC ultracentrifugací a charakterizací.

     Poté, co konfluence buněk dosáhne 80 %, se upravené médium shromáždí pro izolaci exosomů několika ultracentrifugami. Stručně řečeno, po 48 hodinách se upravené médium (CM) buněk centrifuguje při 400 g po dobu 10 minut pro odstranění buněk a při 2500 g po dobu 30 minut pro odstranění apoptotických tělísek a debris. Poté byl CM dvakrát centrifugován při 100 000 g po dobu dvou hodin, následoval proces suspendování exosomové pelety v PBS.

     Povrchové antigeny jsou analyzovány na CD9, CD63 a CD81 pomocí Western blotu. Kromě toho se souprava Bradford Colorimetric Assay (BCA) používá k měření celkového proteinu produkce exosomů při vlnové délce 570 nm. Dynamický rozptyl světla (DLS) určuje distribuci velikosti exozomů.

  4. Extrakce mitochondrií z US-MSC a charakterizace.

  5. Krátkodobé hodnocení bezpečnosti klinické studie transplantace mitochondrií a exosomu fáze I:

     Pacient bude po operaci pečlivě sledován na základě klinických příznaků, známek, arytmie, echokardiografických vyšetření a laboratorních výsledků.

  6. Krátkodobá hodnocení pacienta z hlediska krevních faktorů (cTnT, CK-MB) Kreatinkináza (CK) a její izoenzym CK-MB jsou kritickými nástroji pro diagnostiku akutního infarktu myokardu (AMI). Obsah CK-MB ve vztahu k celkovému CK v buňkách myokardu je variabilní; v normálním myokardu je nízký a několikanásobně zvýšený u hypoxického myokardu a srdeční mrtvice.

  7. SPECT sken, srdeční MRI a dobutaminová stresová skvrnitá echokardiografie, před a po 2 měsících.

     Vyhodnocení rekonvalescence pacienta bude provedeno měsíc po operaci. Toto hodnocení je založeno na příznacích a příznacích pacientů, hodnocení funkčních tříd, skvrnitosti a dobětaminovém stresu Eco, SPECT nukleárního skenování srdce a zobrazování srdce MRI (CMR). Vyhodnocení bude provedeno před operací a jeden měsíc po operaci. Mezi výsledky hodnocení bude provedeno těsné srovnání, aby bylo možné uvést možná zlepšení stavu pacienta.

     Mezi posuzované proměnné pro následné hodnocení patří:

     • Proměnné ejekční frakce z Eco a CMR (LVEF, RVEF, Global EF)
     • 16 Analýza životaschopnosti segmentů pomocí SPECT skenu a CMR
     • Hodnocení klasifikace NYHA založené na fyzickém vyšetření pacienta.
  8. Analýza dat bude provedena pomocí IBM SPSS Statistics verze 25. P-hodnota menší než 0,05 bude hodnocena jako významná.