Skenování meiotického vřeténka v technikách asistované reprodukce k posouzení kvality oocytů (SMART)

Jednou z hlavních strategií léčby neplodnosti je in vitro fertilizace (IVF). Úspěšnost IVF je ovlivněna několika klíčovými faktory, včetně věku ženy, kvality oocytů a stavu zrání a také kvality spermií. Několik autorů navrhlo, že přítomnost, poloha a retardace opticky dvojlomného meiotického vřeténka (MS) souvisí s vývojovou kompetencí oocytů, která ovlivňuje kvalitu fertilizace a vývoje embrya. U oocytů s normální morfologií vřeténka je významně pravděpodobnější, že produkují euploidní embrya ve srovnání s oocyty s meiotickými vřeténky, která nejsou viditelná nebo abnormální. Bylo také navrženo nastavení načasování intracytoplazmatické injekce spermie (ICSI) na základě morfologie RS. Ukázalo se, že úprava času ICSI na základě polohy RS vzhledem k polárnímu tělu (PB) zvyšuje pravděpodobnost úspěšného oplodnění u žen nad 35 let. U oocytů pacientek starších 35 let umožnila delší inkubační doba většímu počtu oocytů plně dozrát (fáze MII) a připravit se na ICSI. V této situaci byl stav RS důležitým indikátorem nezralosti oocytů.

Pacient bude randomizován do tří skupin pomocí Research Electronic Data Capture (REDCap): skupina 1, standardní ICSI bez MS zobrazení; skupina 2, zobrazení RS následované standardní ICSI, skupina 3, zobrazení RS a ICSI fertilizace podle stavu RS. Oocyty od pacientek skupiny 3 s hodnocením RS budou oplodněny podle stavu RS buď 5-6 hodin po odběru vajíčka (OPU) nebo 7-8 hodin po OPU. Oocyty bez vyhodnocení MS budou všechny oplodněny 5-6 hodin po OPU. Vyhodnocení MS bude probíhat v předem připravených miskách se skleněným dnem s cca 5 μl média s HEPES pufrem pokrytým parafinovým olejem, zahřátých jednu hodinu před použitím. Oocyt bude rotován pomocí jehly tak, aby Polar Body (PB) a MS byly dobře viditelné, a fotografie budou pořízeny pomocí optického mikroskopu. Stav MS a úhel (α) mezi MS a PB budou získány 3-4 hodiny po odběru oocytů (OPU). Současně bude pořízen snímek z mikroskopie v polarizovaném světle (mikroskopie v polarizovaném světle při 100násobném zvětšení. Speciálně pro oocyty ze skupiny 3 pacientek s PB/MS v těsné blízkosti (úhel mezi PB a RS < 5°) nebo MS, která není viditelná, budou predikovány jako nezralé oocyty. U těchto oocytů bude ICSI provedena 4-5 hodin po vyhodnocení polarizační mikroskopií, tj. 7-8 hodin po OPU. U oocytů s RS jasně viditelnou a PB/MS ne v těsné blízkosti (úhel mezi PB a RS > 5°) se ICSI provede typicky 2-3 hodiny po vyhodnocení polarizační mikroskopie, tj. 5-6 hodin po OPU, jako např. pacientů z 1 a 2 skupin. ICSI bude prováděno podle standardního protokolu s použitím ICSI/holdingových mikropipet (Microtech IVF, Česká republika), polyvinylpyrrolidonu (ICSI™, Vitrolife, Švédsko) a mikromanipulačního systému Eppendorf (Hamburg, Německo) vybaveného termodeskou (Tokaohit, Japonsko). Oocyty budou kultivovány individuálně a jejich pořadí bude zachováno, aby ostatní výsledky (data z timelapse, klinické výsledky) mohly být spojeny s jednotlivými oocyty. Budeme také sledovat dobu od podání lidského choriového gonadotropinu (hCG) do dokončení vlastního oplodnění. Po OPU budou oocyty obnaženy (HYASE-10X™, Vitrolife, Švédsko) a bude zkoumáno stadium zrání. Oocyt ve stádiu zárodečných váčků (GV) nebude zahrnut. Oocyty a embrya v časosběrném inkubátoru od japonského výrobce Astec budou kultivovány v časosběrné misce Origio, Dánsko Sage 1-Step™, Origio, Dánsko pod parafínovým olejem (OVOIL™, VITROLIFE, Švédsko) při 37,0 °C, 6 % CO2 a 5 % O2. Hnojení po ICSI bude definováno jako přítomnost dvou pronukleí a 2 polárních tělísek 16-20 hodin po ICSI. Embrya budou kultivována po dobu 122-144 hodin.

Pilotní zjištění budou potvrzena v randomizované kontrolní studii, tj. bude hodnocena účinnost použití viditelnosti MS a relativní pozice k polárnímu tělu jako indikátorů zrání oocytů za účelem optimalizace načasování ICSI.