Reakce imunitních buněk na stimuly

Cíl této studie je několikerý. Chceme zjistit odezvu bílých krvinek (neutrofily, monocyty, eozinofily, lymfocyty) na různé signály ve zkumavce, otestovat, jak signály v těle vnímají a jaké látky produkují. Chceme zjistit, jak mohou tyto buňky za určitých okolností přispívat k zánětu. Chceme změřit látky v krevní plazmě, které by mohly přispět ke stimulaci bílých krvinek, abychom pochopili reakci celé krve na potenciální stavy spojené s onemocněním.

Cílem je definovat signální dráhy aktivované lipopolysacharidem (LPS) a dalšími vybranými stimuly přirozené imunity a následné zánětlivé funkční důsledky v lidských leukocytech in vitro. Dospělý (18-65 let) starým), netěhotným, zdravým dobrovolníkům bude odebráno 320 ml plné krve venepunkcí v monitorovaném prostředí ne častěji než jednou za 8 týdnů. Na subjekty nebudou prováděny žádné další zásahy. Celá krev bude frakcionována na neutrofily, červené krvinky, mononukleární buňky a frakce plazmy pomocí diskontinuální centrifugace plasma-Percoll. Leukocyty budou in vitro vystaveny zánětlivým stimulům (např. LPS) a vybraným signálním výsledkům (např. mitogenem aktivovaná proteinkináza aktivace, aktivace Rho GTPázy, interakce protein-protein) a funkčním měřením (např. chemotaxe, superoxidový anion a cytokin produkce) kvantifikované v nepřítomnosti a přítomnosti relevantních chemických inhibitorů (např. SB203580, inhibitor p38 MAPK). V každém takovém experimentu budou buňky od denního dárce použity jako párové kontroly k in vitro experimentální intervenci (např. inhibitor SB203580 vs. vehikulum DMSO). Podle potřeby budou provedena tři nebo více opakování (na různých dárcích) každého specifického experimentálního výsledku, aby se stanovila statistická významnost zjištění.

Specifickým zaměřením plánovaných studií bude definování úlohy mikrodomén lipidové membrány raftu v transdukci signálu LPS v lidských leukocytech. Lipidové rafty jsou mikrodomény bohaté na cholesterol v plazmatické membráně, ve kterých bylo popsáno, že sídlí LPS receptor, Toll-like Receptor 4 (TLR4). Signalizace LPS byla hlášena jako citlivá na obsah raftového cholesterolu, pravděpodobně proto, že specifický repertoár proteinů v raftech je citlivý na obsah raftového cholesterolu. Předpokládá se, že rafty působí jako dynamické signální platformy pro ko-segregaci proximálních adaptorových proteinů, kináz a dalších signálních proteinů. Zajímavé je, že zatímco bylo popsáno, že LPS moduluje aktivitu proteinů, které určují obsah raftového cholesterolu (vajíčko, jaterní X receptor, ABCA1), prakticky nebyla provedena žádná práce k objasnění: 1) mechanismů, které jsou základem LPS-indukované intracelulární redistribuce cholesterolu, a, což je důležitější, 2) zda je taková intracelulární redistribuce cholesterolu kauzální pro signalizační události spouštěné LPS, nebo 3) zda signalizace přirozené imunity závisí na mezisubjektových variacích v obsahu cholesterolu ve raftech.

Dále budeme zkoumat roli tumor supresorového genu p53 v regulaci zánětu. Nyní je široce přijímáno, že zánět a rozvoj rakoviny jsou vzájemně propojeny. Dr. Menendez je jedním z mezinárodních lídrů ve studiu tumor supresorového genu p53. Jeho skupina objevila, že aktivace p53 vystavením karcinogenním stimulům vede k rozdílné expresi genů, které mají přímý vliv na zánětlivou odpověď, jako je několik toll-like-receptorových genů. Dr. Menendez použije lidské leukocyty, které budou izolovány z plné krve. Vystaví tyto buňky stimulům, které aktivují p53, jako je doxorubicin (chemoterapeutické činidlo) nebo záření, a bude zkoumat expresi genů receptorů podobných toll, stejně jako odpověď na LPS a další zánětlivá činidla in vitro.

Nakonec budeme zkoumat roli proteinů zinkových prstů v genové expresi v zánětlivých buňkách. ZFP36 je protein se zinkovým prstem vázající RNA, který se podílí na přeměně mRNA kódujících několik klinicky důležitých cytokinů, včetně TNFa. U lidí bylo identifikováno několik missense, promotorových a 3'-netranslatovaných variant; v některých případech byly tyto varianty a jejich haplotypy spojovány s lidským zánětlivým onemocněním. Budeme izolovat makrofágy periferní krve a stimulovat je LPS a dalšími cytokiny, poté vyhodnotíme chování cytokinové mRNA a genovou expresi.