Risposta delle cellule immunitarie agli stimoli

L'obiettivo di questo studio è multiplo. Desideriamo determinare la risposta dei globuli bianchi (neutrofili, monociti, eosinofili, linfociti) a vari segnali nella provetta, per testare come percepiscono i segnali nel corpo e quali sostanze producono. Desideriamo determinare come queste cellule possono, in determinate circostanze, contribuire all'infiammazione. Desideriamo misurare le sostanze nel plasma sanguigno che potrebbero contribuire alla stimolazione dei globuli bianchi per comprendere la risposta del sangue intero a potenziali condizioni associate a malattie.

L'obiettivo è definire le vie di segnalazione attivate dal lipopolisaccaride (LPS) e da altri stimoli immunitari innati selezionati, e le conseguenze funzionali infiammatorie a valle, nei leucociti umani in vitro. Adulto (18-65 anni. vecchio), i volontari sani non gravidi riceveranno 320 ml di sangue intero raccolto mediante prelievo venoso in un ambiente monitorato non più frequentemente di una volta ogni 8 settimane. Nessun ulteriore intervento sarà esercitato sui soggetti. Il sangue intero sarà frazionato in frazioni di neutrofili, globuli rossi, cellule mononucleate e plasma mediante centrifugazione discontinua di plasma-Percoll. I leucociti saranno sottoposti in vitro a stimoli infiammatori (e.g., LPS), e selezionati esiti di segnalazione (e.g., attivazione della proteina chinasi attivata dal mitogeno, attivazione della Rho GTPasi, interazioni proteina-proteina) e misure funzionali (e.g., chemiotassi, anione superossido e citochina produzione) quantificata in assenza e presenza di inibitori chimici rilevanti (ad esempio, SB203580, un inibitore MAPK p38). In ciascuno di questi esperimenti, le cellule del donatore giornaliero saranno utilizzate come controlli accoppiati per l'intervento sperimentale in vitro (ad esempio, inibitore SB203580 vs. veicolo DMSO). Tre o più ripetizioni (su diversi donatori) di ogni specifico risultato sperimentale, se necessario, saranno eseguite per stabilire la significatività statistica dei risultati.

Un focus specifico degli studi previsti sarà quello di definire il ruolo dei microdomini della membrana del raft lipidico nella trasduzione del segnale LPS nei leucociti umani. I raft lipidici sono microdomini ricchi di colesterolo nella membrana plasmatica, all'interno dei quali è stato descritto risiedere il recettore LPS, Toll-like Receptor 4 (TLR4). È stato segnalato che la segnalazione LPS è sensibile al contenuto di colesterolo della zattera, presumibilmente perché il repertorio specifico di proteine ​​​​nelle zattere è sensibile al contenuto di colesterolo della zattera. Si pensa che i raft agiscano come piattaforme di segnalazione dinamica per la co-segregazione di proteine ​​dell'adattatore prossimale, chinasi e altre proteine ​​di segnalazione. Di interesse, mentre è stato descritto che LPS modula l'attività delle proteine ​​che determinano il contenuto di colesterolo della zattera (uovo, Liver X Receptor, ABCA1), praticamente non è stato fatto alcun lavoro per chiarire: 1) i meccanismi alla base della ridistribuzione del colesterolo intracellulare indotta da LPS, e, cosa più importante, 2) se tale ridistribuzione intracellulare del colesterolo sia causale degli eventi di segnalazione innescati dall'LPS, o 3) se la segnalazione dell'immunità innata dipenda dalle variazioni tra soggetti nel contenuto di colesterolo della zattera.

Inoltre, studieremo il ruolo del gene oncosoppressore p53 nella regolazione dell'infiammazione. È ormai ampiamente accettato che l'infiammazione e lo sviluppo del cancro siano interconnessi. Il Dr. Menendez è uno dei leader internazionali nello studio del gene oncosoppressore p53. Il suo gruppo ha scoperto che l'attivazione di p53 attraverso l'esposizione a stimoli cancerogeni porta all'espressione differenziale di geni che hanno un effetto diretto sulla risposta infiammatoria, come diversi geni del recettore Toll-like. Il Dr. Menendez utilizzerà leucociti umani che saranno isolati dal sangue intero. Egli esporrà queste cellule a stimoli che attivano la p53, come la doxorubicina (un agente chemioterapico) o le radiazioni, ed esaminerà l'espressione dei geni del recettore Toll-like così come la risposta all'LPS e ad altri agenti infiammatori in vitro.

Infine, studieremo il ruolo delle proteine ​​zinc-finger nell'espressione genica nelle cellule infiammatorie. ZFP36 è una proteina zinc finger legante l'RNA che è coinvolta nel turnover degli mRNA che codificano diverse citochine importanti dal punto di vista clinico, incluso il TNFa. Nell'uomo sono state identificate diverse varianti missenso, promotore e 3' non tradotte; in alcuni casi, queste varianti ei loro aplotipi sono stati associati a malattie infiammatorie umane. Isoleremo i macrofagi del sangue periferico e li stimoleremo con LPS e altre citochine, quindi valuteremo il comportamento dell'mRNA delle citochine e l'espressione genica.