Resposta das Células Imunes aos Estímulos

O objetivo deste estudo é múltiplo. Queremos determinar a resposta dos glóbulos brancos (neutrófilos, monócitos, eosinófilos, linfócitos) a vários sinais no tubo de ensaio, para testar como eles percebem os sinais no corpo e quais substâncias eles produzem. Queremos determinar como essas células podem, em certas circunstâncias, contribuir para a inflamação. Queremos medir as substâncias no plasma sanguíneo que podem contribuir para a estimulação dos glóbulos brancos para entender a resposta do sangue total a possíveis condições associadas a doenças.

O objetivo é definir as vias de sinalização ativadas por lipopolissacarídeos (LPS) e outros estímulos selecionados da imunidade inata, e as consequências funcionais inflamatórias a jusante, em leucócitos humanos in vitro. Adulto (18-65 anos. idosas), voluntárias não grávidas e saudáveis ​​terão 320 ml de sangue total coletados por punção venosa em um ambiente monitorado com frequência não superior a uma vez a cada 8 semanas. Nenhuma outra intervenção será exercida sobre os sujeitos. O sangue total será fracionado em frações de neutrófilos, glóbulos vermelhos, células mononucleares e plasma usando centrifugação descontínua de plasma-Percoll. Os leucócitos serão submetidos in vitro a estímulos inflamatórios (por exemplo, LPS) e resultados de sinalização selecionados (por exemplo, ativação de proteína quinase ativada por mitógeno, ativação de Rho GTPase, interações proteína-proteína) e medidas funcionais (por exemplo, quimiotaxia, ânion superóxido e citocina produção) quantificada na ausência e presença de inibidores químicos relevantes (por exemplo, SB203580, um inibidor de p38 MAPK). Em cada um desses experimentos, as células do doador diário serão usadas como controles pareados para a intervenção experimental in vitro (por exemplo, inibidor SB203580 vs. veículo DMSO). Três ou mais repetições (em doadores diferentes) de cada resultado experimental específico, conforme necessário, serão realizadas para estabelecer a significância estatística dos resultados.

Um foco específico dos estudos planejados será definir o papel dos microdomínios da membrana da balsa lipídica na transdução do sinal LPS em leucócitos humanos. As jangadas lipídicas são microdomínios ricos em colesterol na membrana plasmática, dentro dos quais foi descrito que reside o receptor LPS, Toll-like Receptor 4 (TLR4). Foi relatado que a sinalização de LPS é sensível ao teor de colesterol de jangadas, presumivelmente porque o repertório específico de proteínas em jangadas é sensível ao teor de colesterol de jangadas. Pensa-se que as balsas atuem como plataformas de sinalização dinâmica para co-segregação de proteínas adaptadoras proximais, quinases e outras proteínas de sinalização. De interesse, embora o LPS tenha sido descrito para modular a atividade de proteínas que determinam o conteúdo de colesterol da jangada (ovo, Fígado X Receptor, ABCA1), praticamente nenhum trabalho foi feito para esclarecer: 1) os mecanismos subjacentes à redistribuição do colesterol intracelular induzida por LPS, e, mais importante, 2) se tal redistribuição intracelular de colesterol é causal para os eventos de sinalização desencadeados por LPS, ou 3) se a sinalização de imunidade inata depende de variações entre indivíduos no conteúdo de colesterol de balsa.

Além disso, investigaremos o papel do gene supressor de tumor p53 na regulação da inflamação. Agora é amplamente aceito que a inflamação e o desenvolvimento do câncer estão interligados. O Dr. Menendez é um dos líderes internacionais no estudo do gene supressor de tumor p53. Seu grupo descobriu que a ativação de p53 por meio da exposição a estímulos cancerígenos leva à expressão diferencial de genes que têm efeito direto na resposta inflamatória, como vários genes receptores do tipo toll. O Dr. Menendez usará leucócitos humanos que serão isolados do sangue total. Ele exporá essas células a estímulos que ativam p53, como a doxorrubicina (um agente quimioterápico) ou radiação, e examinará a expressão de genes de receptores semelhantes a toll, bem como a resposta a LPS e outros agentes inflamatórios in vitro.

Por fim, investigaremos o papel das proteínas zinc-finger na expressão gênica em células inflamatórias. ZFP36 é uma proteína dedo de zinco de ligação ao RNA que está envolvida na renovação de mRNAs que codificam várias citocinas importantes clinicamente, incluindo TNFa. Várias variantes sem sentido, do promotor e não traduzidas em 3' foram identificadas em humanos; em alguns casos, essas variantes e seus haplótipos foram associados a doenças inflamatórias humanas. Iremos isolar macrófagos do sangue periférico e estimulá-los com LPS e outras citocinas, em seguida avaliaremos o comportamento do mRNA das citocinas e a expressão gênica.