Immuncellerespons på stimuli

Formålet med denne undersøgelse er flere gange. Vi ønsker at bestemme, hvordan hvide blodlegemer (neutrofiler, monocytter, eosinofiler, lymfocytter) reagerer på forskellige signaler i reagensglasset, for at teste, hvordan de mærker signalerne i kroppen, og hvilke stoffer de producerer. Vi ønsker at afgøre, hvordan disse celler under visse omstændigheder kan bidrage til inflammation. Vi ønsker at måle de stoffer i blodplasmaet, der kan bidrage til stimulering af hvide blodlegemer for at forstå fuldblodets reaktion på potentielle sygdomsrelaterede tilstande.

Målet er at definere de signalveje, der aktiveres af lipopolysaccharid (LPS) og andre udvalgte medfødte immunitetsstimuli, og de nedstrøms inflammatoriske funktionelle konsekvenser i humane leukocytter in vitro. Voksen (18-65 år. gamle), ikke-gravide, raske frivillige vil få 320 ml fuldblod opsamlet ved venepunktur i et overvåget miljø, højst én gang hver 8. uge. Der vil ikke blive foretaget yderligere indgreb på emnerne. Fuldblodet vil blive fraktioneret til neutrofile, røde blodlegemer, mononukleære celler og plasmafraktioner ved hjælp af plasma-Percoll diskontinuerlig centrifugering. Leukocytter vil blive udsat in vitro for inflammatoriske stimuli (f.eks. LPS) og udvalgte signalresultater (f.eks. mitogenaktiveret proteinkinaseaktivering, Rho GTPase-aktivering, protein-protein-interaktioner) og funktionelle mål (f.eks. kemotaksi, superoxidanion og cytokin) produktion) kvantificeret i fravær og tilstedeværelse af relevante kemiske inhibitorer (f.eks. SB203580, en p38 MAPK-hæmmer). I hvert sådant eksperiment vil celler fra den daglige donor blive brugt som parrede kontroller til den in vitro eksperimentelle intervention (f.eks. SB203580-hæmmer vs. DMSO-vehikel). Tre eller flere gentagelser (på forskellige donorer) af hvert specifikt forsøgsresultat vil efter behov blive udført for at fastslå statistisk signifikans af fund.

Et specifikt fokus for de planlagte undersøgelser vil være at definere rollen af ​​lipid raft-membran-mikrodomæner i transduktion af LPS-signalet i humane leukocytter. Lipid rafts er kolesterolrige mikrodomæner i plasmamembranen, inden for hvilke LPS-receptoren, Toll-like Receptor 4 (TLR4), er blevet beskrevet at opholde sig. LPS-signalering er blevet rapporteret at være følsom over for flådens kolesterolindhold, formentlig fordi det specifikke repertoire af proteiner i flåder er følsomt over for flådens kolesterolindhold. Flåder menes at fungere som dynamiske signaleringsplatforme til co-segregation af proksimale adapterproteiner, kinaser og andre signalproteiner. Af interesse, mens LPS er blevet beskrevet for at modulere aktiviteten af ​​proteiner, der bestemmer flådens kolesterolindhold (æg, lever X-receptor, ABCA1), er der praktisk taget intet arbejde blevet udført for at klarlægge: 1) mekanismerne bag LPS-induceret intracellulær kolesterolomfordeling, og, endnu vigtigere, 2) om en sådan intracellulær omfordeling af kolesterol er årsag til signalbegivenhederne udløst af LPS, eller 3) om medfødt immunitetssignalering er afhængig af inter-individuelle variationer i flådens kolesterolindhold.

Endvidere vil vi undersøge rollen af ​​tumorsuppressorgenet p53 i reguleringen af ​​inflammation. Det er nu almindeligt accepteret, at inflammation og kræftudvikling hænger sammen. Dr. Menendez er en af ​​de internationale ledere i studiet af tumorsuppressorgenet p53. Hans gruppe har opdaget, at aktivering af p53 gennem eksponering for kræftfremkaldende stimuli fører til differentiel ekspression af gener, der har en direkte effekt på det inflammatoriske respons, såsom flere toll-lignende receptorgener. Dr. Menendez vil bruge humane leukocytter, der vil blive isoleret fra fuldblod. Han vil udsætte disse celler for stimuli, der aktiverer p53, såsom doxorubicin (et kemoterapimiddel) eller stråling, og undersøge ekspressionen af ​​toll-like-receptor-gener samt responsen på LPS og andre inflammatoriske midler in vitro.

Til sidst vil vi undersøge zink-fingerproteiners rolle i genekspression i inflammatoriske celler. ZFP36 er et RNA-bindende zinkfingerprotein, der er involveret i omsætningen af ​​mRNA'er, der koder for flere klinisk vigtige cytokiner, herunder TNFa. Adskillige missense-, promotor- og 3'-utranslaterede varianter er blevet identificeret hos mennesker; i nogle tilfælde er disse varianter og deres haplotyper blevet forbundet med human inflammatorisk sygdom. Vi vil isolere perifere blodmakrofager og stimulere dem med LPS og andre cytokiner, derefter evaluere adfærden af ​​cytokin-mRNA og genekspression.