Reaktion der Immunzellen auf Stimuli

Das Ziel dieser Studie ist mehrfach. Wir wollen die Reaktion weißer Blutkörperchen (Neutrophile, Monozyten, Eosinophile, Lymphozyten) auf verschiedene Signale im Reagenzglas bestimmen, um zu testen, wie sie die Signale im Körper wahrnehmen und welche Substanzen sie produzieren. Wir wollen herausfinden, wie diese Zellen unter bestimmten Umständen zur Entzündung beitragen können. Wir möchten die Substanzen im Blutplasma messen, die zur Stimulierung der weißen Blutkörperchen beitragen könnten, um die Reaktion des Vollbluts auf mögliche krankheitsassoziierte Zustände zu verstehen.

Ziel ist es, die durch Lipopolysaccharid (LPS) und andere ausgewählte Stimuli der angeborenen Immunität aktivierten Signalwege und die nachgelagerten entzündlichen funktionellen Folgen in humanen Leukozyten in vitro zu definieren. Erwachsene (18-65 J. alt), nicht schwangeren, gesunden Freiwilligen werden 320 ml Vollblut durch Venenpunktion in einer überwachten Umgebung nicht häufiger als einmal alle 8 Wochen entnommen. An den Subjekten werden keine weiteren Eingriffe vorgenommen. Das Vollblut wird mittels diskontinuierlicher Plasma-Percoll-Zentrifugation in Neutrophile, rote Blutkörperchen, mononukleäre Zellen und Plasmafraktionen fraktioniert. Leukozyten werden in vitro Entzündungsreizen (z. B. LPS) und ausgewählten Signalisierungsergebnissen (z. B. Mitogen-aktivierte Proteinkinase-Aktivierung, Rho-GTPase-Aktivierung, Protein-Protein-Wechselwirkungen) und funktionellen Maßnahmen (z. B. Chemotaxis, Superoxidanion und Zytokin) ausgesetzt Produktion) quantifiziert in Abwesenheit und Gegenwart relevanter chemischer Inhibitoren (z. B. SB203580, ein p38-MAPK-Inhibitor). In jedem dieser Experimente werden Zellen des täglichen Spenders als gepaarte Kontrollen für die experimentelle In-vitro-Intervention verwendet (z. B. SB203580-Inhibitor vs. DMSO-Vehikel). Je nach Bedarf werden drei oder mehr Wiederholungen (an verschiedenen Spendern) jedes spezifischen experimentellen Ergebnisses durchgeführt, um die statistische Signifikanz der Ergebnisse festzustellen.

Ein besonderer Schwerpunkt der geplanten Studien wird darin bestehen, die Rolle von Lipid-Raft-Membran-Mikrodomänen bei der Transduktion des LPS-Signals in menschlichen Leukozyten zu definieren. Lipidflöße sind cholesterinreiche Mikrodomänen in der Plasmamembran, in denen der LPS-Rezeptor Toll-like Receptor 4 (TLR4) beschrieben wurde. Es wurde berichtet, dass die LPS-Signalübertragung empfindlich auf den Cholesteringehalt des Floßes reagiert, vermutlich weil das spezifische Repertoire an Proteinen in den Flößen empfindlich auf den Cholesteringehalt des Floßes reagiert. Es wird angenommen, dass Rafts als dynamische Signalplattformen für die Co-Segregation von proximalen Adapterproteinen, Kinasen und anderen Signalproteinen fungieren. Interessanterweise wurde zwar beschrieben, dass LPS die Aktivität von Proteinen moduliert, die den Floßcholesteringehalt bestimmen (z. B. Leber-X-Rezeptor, ABCA1), aber es wurden praktisch keine Arbeiten durchgeführt, um Folgendes zu klären: 1) die Mechanismen, die der LPS-induzierten intrazellulären Cholesterinumverteilung zugrunde liegen, und, was noch wichtiger ist, 2) ob eine solche intrazelluläre Umverteilung von Cholesterin ursächlich für die Signalisierungsereignisse ist, die durch LPS ausgelöst werden, oder 3) ob die Signalgebung der angeborenen Immunität von interindividuellen Schwankungen des Floßcholesteringehalts abhängt.

Darüber hinaus werden wir die Rolle des Tumorsuppressorgens p53 bei der Entzündungsregulation untersuchen. Es ist heute allgemein anerkannt, dass Entzündungen und Krebsentstehung miteinander verbunden sind. Dr. Menendez ist einer der international führenden Wissenschaftler in der Erforschung des Tumorsuppressorgens p53. Seine Gruppe hat entdeckt, dass die Aktivierung von p53 durch krebserregende Reize zu einer unterschiedlichen Expression von Genen führt, die eine direkte Wirkung auf die Entzündungsreaktion haben, wie etwa mehrere Toll-Like-Rezeptor-Gene. Dr. Menendez wird menschliche Leukozyten verwenden, die aus Vollblut isoliert werden. Er wird diese Zellen Stimuli aussetzen, die p53 aktivieren, wie Doxorubicin (ein Chemotherapeutikum) oder Bestrahlung, und die Expression von Toll-Like-Rezeptor-Genen sowie die Reaktion auf LPS und andere Entzündungsstoffe in vitro untersuchen.

Schließlich werden wir die Rolle von Zinkfingerproteinen in der Genexpression in Entzündungszellen untersuchen. ZFP36 ist ein RNA-bindendes Zinkfingerprotein, das am Turnover von mRNAs beteiligt ist, die mehrere klinisch wichtige Zytokine codieren, darunter TNFa. Beim Menschen wurden mehrere Missense-, Promotor- und 3'-untranslatierte Varianten identifiziert; in einigen Fällen wurden diese Varianten und ihre Haplotypen mit entzündlichen Erkrankungen beim Menschen in Verbindung gebracht. Wir werden periphere Blutmakrophagen isolieren und sie mit LPS und anderen Zytokinen stimulieren und dann das Verhalten der Zytokin-mRNA und der Genexpression auswerten.