Az immunsejtek válasza az ingerekre

Ennek a tanulmánynak több célja is van. Szeretnénk meghatározni a fehérvérsejtek (neutrofilek, monociták, eozinofilek, limfociták) reakcióját a kémcsőben lévő különböző jelekre, tesztelni, hogyan érzékelik a szervezetben a jeleket, milyen anyagokat termelnek. Szeretnénk meghatározni, hogy ezek a sejtek bizonyos körülmények között hogyan járulhatnak hozzá a gyulladáshoz. Meg akarjuk mérni a vérplazmában azokat az anyagokat, amelyek hozzájárulhatnak a fehérvérsejtek stimulálásához, hogy megértsük a teljes vér válaszát a lehetséges betegséggel összefüggő állapotokra.

A cél a lipopoliszacharid (LPS) és más kiválasztott veleszületett immunstimulusok által aktivált jelátviteli útvonalak, valamint a downstream gyulladásos funkcionális következmények meghatározása humán leukocitákban in vitro. Felnőtt (18-65 év) idős), nem terhes, egészséges önkéntesek 320 ml teljes vért vesznek vénapunkcióval, ellenőrzött körülmények között, legfeljebb 8 hetente egyszer. Az alanyokon további beavatkozás nem történik. A teljes vért neutrofilekre, vörösvérsejtekre, mononukleáris sejtekre és plazmafrakciókra frakcionálják plazma-Percoll szakaszos centrifugálással. A leukocitákat in vitro gyulladásos ingereknek (például LPS) és kiválasztott jelátviteli eredményeknek (pl. mitogén által aktivált protein kináz aktiválás, Rho GTPáz aktiválás, fehérje-fehérje kölcsönhatások) és funkcionális intézkedéseknek (pl. kemotaxis, szuperoxid anion és citokin) vetik alá. termelés) mennyiségileg a releváns kémiai inhibitorok (például SB203580, p38 MAPK inhibitor) hiányában és jelenlétében határozzuk meg. Minden ilyen kísérletben a napi donor sejtjeit használjuk páros kontrollként az in vitro kísérleti beavatkozáshoz (például SB203580 inhibitor kontra DMSO vivőanyag). Szükség esetén minden egyes kísérleti eredmény három vagy több megismétlését (különböző donorokon) kell elvégezni a leletek statisztikai szignifikanciájának megállapítására.

A tervezett tanulmányok specifikus fókusza a lipid raft membrán mikrodomének szerepének meghatározása lesz az LPS jel transzdukciójában humán leukocitákban. A lipid tutajok koleszterinben gazdag mikrodomének a plazmamembránban, amelyben a leírások szerint az LPS receptor, a Toll-like Receptor 4 (TLR4) található. Az LPS jelátvitelről számoltak be, hogy érzékeny a tutaj koleszterin-tartalmára, feltehetően azért, mert a tutajokban lévő fehérjék specifikus repertoárja érzékeny a tutaj koleszterintartalmára. Úgy gondolják, hogy a tutajok dinamikus jelátviteli platformként működnek a proximális adapterfehérjék, kinázok és más jelátviteli fehérjék együttes szegregációjában. Érdekesség, hogy bár az LPS-ről leírták, hogy modulálja a tutaj koleszterin tartalmát meghatározó fehérjék (tojás, máj X-receptor, ABCA1) aktivitását, gyakorlatilag semmilyen munka nem történt a következők tisztázására: 1) az LPS által kiváltott intracelluláris koleszterin újraeloszlásának hátterében álló mechanizmusok, és ami még fontosabb, 2) a koleszterin ilyen intracelluláris újraeloszlása ​​okozza-e az LPS által kiváltott jelátviteli eseményeket, vagy 3) a veleszületett immunitás jelátvitele függ-e a tutaj koleszterintartalmának egyedek közötti változásaitól.

Továbbá megvizsgáljuk a p53 tumorszuppresszor gén szerepét a gyulladás szabályozásában. Ma már széles körben elfogadott, hogy a gyulladás és a rák kialakulása összefügg. Dr. Menendez a p53 tumorszuppresszor gén vizsgálatának egyik nemzetközi vezetője. Csoportja felfedezte, hogy a p53 aktiválása karcinogén ingereknek való kitételen keresztül olyan gének eltérő expressziójához vezet, amelyek közvetlen hatással vannak a gyulladásos válaszra, mint például számos vámszerű receptor gén. Dr. Menendez emberi leukocitákat fog használni, amelyeket teljes vérből izolálnak. Ezeket a sejteket olyan ingereknek teszi ki, amelyek aktiválják a p53-at, például a doxorubicint (egy kemoterápiás szer) vagy a sugárzást, és megvizsgálja a toll-like-receptor gének expresszióját, valamint az LPS-re és más gyulladásos ágensekre adott választ in vitro.

Végül megvizsgáljuk a cink-ujj fehérjék szerepét a gyulladásos sejtek génexpressziójában. A ZFP36 egy RNS-kötő cinkujj fehérje, amely részt vesz számos klinikailag fontos citokint, köztük a TNFa-t kódoló mRNS-ek forgalmában. Számos missense, promoter és 3'-nem transzlálódó variánst azonosítottak emberekben; egyes esetekben ezeket a változatokat és haplotípusaikat összefüggésbe hozták emberi gyulladásos betegséggel. A perifériás vér makrofágjait izoláljuk és LPS-sel és más citokinekkel stimuláljuk, majd értékeljük a citokin mRNS viselkedését és a génexpressziót.