Immuunisolujen vaste ärsykkeisiin

Tämän tutkimuksen tavoite on monitahoinen. Haluamme selvittää valkoisten verisolujen (neutrofiilit, monosyytit, eosinofiilit, lymfosyytit) vastetta erilaisiin koeputken signaaleihin, testata, miten ne havaitsevat signaalit kehossa ja mitä aineita ne tuottavat. Haluamme määrittää, kuinka nämä solut voivat tietyissä olosuhteissa edistää tulehdusta. Haluamme mitata veriplasman aineita, jotka voivat edistää valkosolujen stimulaatiota, jotta voimme ymmärtää kokoveren vasteen mahdollisiin sairauksiin liittyviin tiloihin.

Tavoitteena on määrittää lipopolysakkaridin (LPS) ja muiden valikoitujen synnynnäisten immuniteettiärsykkeiden aktivoimat signalointireitit sekä alavirran tulehdukselliset toiminnalliset seuraukset ihmisen leukosyyteissä in vitro. Aikuinen (18-65 v. vanhat), ei-raskaana olevilta terveiltä vapaaehtoisilta kerätään 320 ml kokoverta laskimopunktiolla valvotussa ympäristössä enintään kerran 8 viikossa. Aiheisiin ei enää puututa. Kokoveri fraktioidaan neutrofiileiksi, punasoluiksi, yksitumasoluiksi ja plasmafraktioiksi käyttämällä plasma-Percoll-epäjatkuvaa sentrifugointia. Leukosyytit altistetaan in vitro tulehdusärsykkeille (esim. LPS) ja valituille signaalituloksille (esim. mitogeenin aktivoima proteiinikinaasiaktivaatio, Rho GTPaasin aktivaatio, proteiini-proteiinivuorovaikutukset) ja toiminnallisille toimenpiteille (esim. kemotaksis, superoksidianioni ja sytokiini) tuotanto) kvantifioitu relevanttien kemiallisten estäjien (esim. SB203580, p38 MAPK:n estäjä) puuttuessa ja läsnä ollessa. Jokaisessa tällaisessa kokeessa päivittäisen luovuttajan soluja käytetään parikontrolleina in vitro -kokeellisessa interventiossa (esim. SB203580-inhibiittori vs. DMSO-vehikkeli). Tarvittaessa suoritetaan kolme tai useampi toisto (eri luovuttajille) jokaisesta koetuloksesta tulosten tilastollisen merkityksen määrittämiseksi.

Suunniteltujen tutkimusten erityisenä painopisteenä on määrittää lipidilauttakalvon mikrodomeenien rooli LPS-signaalin transduktiossa ihmisen leukosyyteissä. Lipidilautat ovat runsaasti kolesterolia sisältäviä mikrodomeeneja plasmakalvossa, joissa LPS-reseptorin, Toll-like Receptor 4:n (TLR4), on kuvattu asuvan. LPS-signaloinnin on raportoitu olevan herkkä lautan kolesterolipitoisuudelle, oletettavasti siksi, että lauttojen spesifinen proteiinivalikoima on herkkä lautan kolesterolipitoisuudelle. Lauttojen uskotaan toimivan dynaamisina signalointialustoina proksimaalisten adapteriproteiinien, kinaasien ja muiden signalointiproteiinien yhteissegregaatiossa. Mielenkiintoista on, että vaikka LPS:n on kuvattu moduloivan lautan kolesterolipitoisuutta määrittävien proteiinien (muna, maksan X-reseptori, ABCA1) aktiivisuutta, käytännössä ei ole tehty mitään työtä selventääkseen: 1) LPS:n aiheuttaman solunsisäisen kolesterolin uudelleenjakautumisen taustalla olevia mekanismeja, ja mikä vielä tärkeämpää, 2) onko tällainen kolesterolin solunsisäinen uudelleenjakautuminen syy-yhteyttä LPS:n laukaisemiin signalointitapahtumiin, tai 3) onko synnynnäinen immuniteettisignalointi riippuvainen koehenkilöiden välisistä vaihteluista lautan kolesterolipitoisuudessa.

Lisäksi tutkimme kasvainsuppressorigeenin p53 roolia tulehduksen säätelyssä. Nykyään on yleisesti hyväksytty, että tulehdus ja syövän kehittyminen liittyvät toisiinsa. Tohtori Menendez on yksi kansainvälisistä johtajista kasvainsuppressorigeenin p53 tutkimuksessa. Hänen ryhmänsä on havainnut, että p53:n aktivoituminen altistumalla karsinogeenisille ärsykkeille johtaa geenien, kuten useiden maksun kaltaisten reseptorigeenien, erilaiseen ilmentymiseen, joilla on suora vaikutus tulehdusvasteeseen. Tohtori Menendez käyttää ihmisen leukosyyttejä, jotka eristetään kokoverestä. Hän altistaa nämä solut ärsykkeille, jotka aktivoivat p53:n, kuten doksorubisiinin (kemoterapiaaine) tai säteilyn, ja tutkii toll-like-reseptorigeenien ilmentymistä sekä vastetta LPS:lle ja muille tulehdusaineille in vitro.

Lopuksi tutkimme sinkkisormiproteiinien roolia geeniekspressiossa tulehdussoluissa. ZFP36 on RNA:ta sitova sinkkisormiproteiini, joka osallistuu useita kliinisesti tärkeitä sytokiinejä, mukaan lukien TNFa:ta, koodaavien mRNA:iden kiertoon. Ihmisillä on tunnistettu useita missense-, promoottori- ja 3'-transloitumattomia variantteja; joissakin tapauksissa nämä variantit ja niiden haplotyypit on liitetty ihmisen tulehdussairauteen. Eristämme perifeerisen veren makrofagit ja stimuloimme niitä LPS:llä ja muilla sytokiineilla, minkä jälkeen arvioimme sytokiinien mRNA:n ja geeniekspression käyttäytymistä.