Respuesta de las células inmunitarias a los estímulos

El objetivo de este estudio es múltiple. Deseamos determinar la respuesta de los glóbulos blancos (neutrófilos, monocitos, eosinófilos, linfocitos) a varias señales en el tubo de ensayo, para probar cómo perciben las señales en el cuerpo y qué sustancias producen. Deseamos determinar cómo estas células pueden, bajo ciertas circunstancias, contribuir a la inflamación. Deseamos medir las sustancias en el plasma sanguíneo que podrían contribuir a la estimulación de los glóbulos blancos para comprender la respuesta de la sangre completa a las posibles condiciones asociadas a enfermedades.

El objetivo es definir las vías de señalización activadas por lipopolisacáridos (LPS) y otros estímulos de inmunidad innata seleccionados, y las consecuencias funcionales inflamatorias aguas abajo, en leucocitos humanos in vitro. Adulto (18-65 años. de edad), voluntarios sanos no embarazadas tendrán 320 ml de sangre total recolectada por punción venosa en un entorno monitoreado con una frecuencia no mayor a una vez cada 8 semanas. No se ejercerán más intervenciones sobre los sujetos. La sangre completa se fraccionará en fracciones de neutrófilos, glóbulos rojos, células mononucleares y plasma mediante centrifugación discontinua de plasma-Percoll. Los leucocitos se someterán in vitro a estímulos inflamatorios (p. ej., LPS) y resultados de señalización seleccionados (p. ej., activación de proteína quinasa activada por mitógeno, activación de Rho GTPasa, interacciones proteína-proteína) y medidas funcionales (p. ej., quimiotaxis, anión superóxido y citoquina producción) cuantificada en ausencia y presencia de inhibidores químicos relevantes (p. ej., SB203580, un inhibidor de p38 MAPK). En cada uno de estos experimentos, las células del donante diario se utilizarán como controles emparejados para la intervención experimental in vitro (p. ej., inhibidor de SB203580 frente a vehículo DMSO). Se realizarán tres o más repeticiones (en diferentes donantes) de cada resultado experimental específico, según sea necesario, para establecer la importancia estadística de los hallazgos.

Un enfoque específico de los estudios planificados será definir el papel de los microdominios de membrana de balsa lipídica en la transducción de la señal LPS en leucocitos humanos. Las balsas lipídicas son microdominios ricos en colesterol en la membrana plasmática, dentro de los cuales se ha descrito que reside el receptor de LPS, Toll-like Receptor 4 (TLR4). Se ha informado que la señalización de LPS es sensible al contenido de colesterol de la balsa, presumiblemente porque el repertorio específico de proteínas en las balsas es sensible al contenido de colesterol de la balsa. Se cree que las balsas actúan como plataformas de señalización dinámica para la segregación conjunta de proteínas adaptadoras proximales, quinasas y otras proteínas de señalización. De interés, aunque se ha descrito que el LPS modula la actividad de las proteínas que determinan el contenido de colesterol en balsa (huevo, receptor X hepático, ABCA1), prácticamente no se ha realizado ningún trabajo para aclarar: 1) los mecanismos subyacentes a la redistribución del colesterol intracelular inducida por LPS, y, lo que es más importante, 2) si dicha redistribución intracelular de colesterol es causal de los eventos de señalización desencadenados por LPS, o 3) si la señalización de la inmunidad innata depende de las variaciones entre sujetos en el contenido de colesterol total.

Además, investigaremos el papel del gen supresor de tumores p53 en la regulación de la inflamación. Ahora se acepta ampliamente que la inflamación y el desarrollo del cáncer están interconectados. El Dr. Menéndez es uno de los líderes internacionales en el estudio del gen supresor de tumores p53. Su grupo ha descubierto que la activación de p53 a través de la exposición a estímulos cancerígenos conduce a la expresión diferencial de genes que tienen un efecto directo sobre la respuesta inflamatoria, como varios genes de receptores tipo toll. El Dr. Menéndez utilizará leucocitos humanos que se aislarán de sangre completa. Expondrá estas células a estímulos que activan p53, como la doxorrubicina (un agente quimioterapéutico) o la radiación, y examinará la expresión de genes de receptores tipo toll, así como la respuesta a LPS y otros agentes inflamatorios in vitro.

Finalmente, investigaremos el papel de las proteínas con dedos de zinc en la expresión génica en células inflamatorias. ZFP36 es una proteína con dedos de zinc que se une al ARN y que está implicada en la renovación de los ARNm que codifican varias citocinas importantes desde el punto de vista clínico, incluido el TNFa. Se han identificado en humanos varias variantes sin sentido, promotoras y 3' no traducidas; en algunos casos, estas variantes y sus haplotipos se han asociado con enfermedades inflamatorias humanas. Aislaremos macrófagos de sangre periférica y los estimularemos con LPS y otras citoquinas, luego evaluaremos el comportamiento del ARNm de citoquinas y la expresión génica.