Identifikace časných prediktorů fetomaternálního krvácení

1. Úvod:

   Cílem této studie je identifikovat kandidátní klinické prediktory fetomaternálního krvácení (FMH) a navrhnout strategii screeningu k identifikaci těhotenství postižených tímto stavem dříve, než je plod ohrožen těžkou anémií.

   Fetomaternální krvácení je stav, kdy selhává placentární bariéra a plod „krvácí“ do mateřského oběhu. Při správném fungování placenta umožňuje přenos živin a odpadu mezi matkou a plodem, přičemž buněčné složky krve zůstávají oddělené. Není neobvyklé, že se malé množství fetální krve dostane do mateřského oběhu bez nepříznivého účinku na plod. Ve skutečnosti lze mírnou FMH detekovat až u 75 % normálních těhotenství. Přibližně u 3 z 1000 těhotenství však objem fetální krve přenesený na matku způsobí klinicky významnou anémii plodu. Fetální anémie může způsobit významnou morbiditu a mortalitu. U plodů, které přežijí těžkou anémii, je běžná celoživotní invalidita.

   Diagnóza FMH se nejčastěji provádí po nepříznivém fetálním nebo neonatálním výsledku, což naznačuje potřebu testování. Časné rizikové faktory FMH nejsou známy. Klinické prediktory FMH byly navrženy, ale nebyly potvrzeny v retrospektivní studii. Současný standard testování péče o FMH, Kleihauer-Betke (KB) kyselý eluční test, je pracný a časově náročný, a proto drahý. Navíc je KB test závislý na pozorovateli a může být významně ovlivněn odchylkami v přípravě vzorku. Neexistuje žádný screeningový protokol pro FMH s automatickým laboratorním testováním vhodným pro použití v běžné těhotné populaci.

   Specifický cíl: Identifikovat vhodný laboratorní protokol pro diagnostiku fetomaternálního krvácení prospektivní studií a pilotovat studii, která má určit časné klinické prediktory mírného fetomaternálního krvácení.

2. Pozadí a význam Fetomaternální krvácení nastává, když je narušen normální průtok krve v placentě a buněčné složky fetální krve procházejí do mateřského oběhu. Zdravá placenta umožňuje přenos rozpuštěných látek mezi matkou a plodem a zároveň udržuje buněčné složky obou oběhu oddělené. Je běžné, že placentární filtr během normálních těhotenství "prosakuje", což vede k přenosu malých objemů plné krve plodu do krevního řečiště matky. Objemy fetální krve pod 1 ml lze detekovat až u 75 % těhotenství. Tento objem ztráty krve je považován za klinicky nevýznamný pro plod. Těžká FMH s velkým objemem přenosu krve z plodu na matku je méně častá. Ačkoli se diskutuje o přesném objemu krevního transferu potřebného ke klasifikaci FMH jako „závažného“, je jasné, že významné akutní nebo chronické krvácení vede k nepříznivému perinatálnímu výsledku. Odhady výskytu těžké FMH se liší, především proto, že neexistují žádné komplexní epidemiologické studie tohoto stavu. Odhady založené na screeningu Rh aloimunizace u Rho(d) negativních žen naznačují, že těžká FMH se vyskytuje u 1-3 z 1000 těhotenství, ale představuje téměř 14 % jinak nevysvětlených úmrtí plodu. Velký objem FMH může vést k těžké fetální anémii. Ačkoli se fetální anémie může projevit in utero s rozpoznaným hydropsem fetalis nebo omezením intrauterinního růstu, častěji se nevyskytují žádné vnější známky těžké anémie související s FMH před porodem mrtvého plodu, fetální tísně při porodu nebo neonatální kritické nemoci. Bezprostřední následky těžké FMH u novorozenců, kteří přežijí porod, zahrnují devastující onemocnění, jako je perzistence fetálního oběhu, hypovolemický šok a hypoxicko-ischemická encefalopatie. Mezi konečné škodlivé následky patří vysoká míra mentální retardace, dětská mozková obrna, neurologická devastace a smrt. Navzdory těmto důsledkům a podezření na nedávný nárůst incidence těžké FMH zůstávají časné prediktory těžké FMH neznámé a ve více než 80 % případů nelze identifikovat žádnou příčinu krvácení. Rizikové faktory pro matku nebo těhotenství vhodné pro časný screening nebo diagnostiku těžké FMH v běžné těhotné populaci nebyly objasněny. Pokud je fetální anémie z FMH identifikována před porodem, může být úspěšně zvládnuta intrauterinní fetální transfuzí a porodem před začátkem porodu. , Výsledky po léčbě fetální anémie fetální transfuzí, dokonce i opakovanou fetální transfuzí, jsou povzbudivé. Empirické prediktory FMH by tedy nabízely okamžitý příslib zlepšení klinických výsledků. Sociální a finanční náklady na počáteční intenzivní péči a dlouhodobou chronickou péči o děti s kognitivním a motorickým postižením v důsledku FMH jsou značné. Existuje značná potřeba včasné identifikace rizik a praktické screeningové strategie ke zmírnění lidských a ekonomických nákladů závažných FMH.

Validované klinické prediktory FMH zahrnují snížený pohyb plodu, sinusové sledování srdeční frekvence plodu a hydrops plodu. Tyto markery nejsou užitečné pro prevenci nežádoucích příhod pocházejících z FMH, protože každý znamená prokázanou závažnou fetální anémii. Mateřské charakteristiky údajně zvyšující riziko FMH zahrnují hypertenzi, abrupci placenty, zneužívání návykových látek a trauma. Ty byly hodnoceny v retrospektivní studii mrtvě narozených dětí ve studii z roku 1999. Žádná nebyla významně spojena s FMH. Klinické charakteristiky s podezřením na souvislost s FMH byly hodnoceny ve studii z roku 2004 u Rho(d)-negativních žen. Pouze dvojčetné těhotenství bylo významně spojeno s FMH. Není známo, zda je výskyt FMH u vícečetných těhotenství vyšší než u jednočetných těhotenství. Nebyl publikován žádný prospektivní ani retrospektivní epidemiologický průzkum FMH v obecné populaci těhotných. Neexistuje žádný epidemiologický popis v celém spektru (mírné, střední, těžké) FMH. Žádná série placentárních patologií získaných z případů FMH nebyla dokončena.

V současné době, i když jsou riziková těhotenství hodná screeningu identifikována před zničujícím výsledkem, laboratorní testování na FMH není jednoduché. Nejčastěji používaným laboratorním testem pro detekci a kvantifikaci objemu fetální krve v mateřském oběhu je Kleihauer-Betke (KB) kyselý eluční test. Činidla pro test KB jsou relativně levná, ale test je závislý na operátorovi a je náročný na práci, což z něj činí nepřitažlivého kandidáta pro použití v rozšířeném screeningu. Test je založen na skutečnosti, že kyselý eluent bude lyzovat křehké mateřské erytrocyty, zatímco fetální hemoglobin stabilizuje fetální erytrocyty. Odebere se mateřská krev a vystaví se kyselému eluentu. Zbývající intaktní fetální buňky se obarví a spočítají. Odhady celkového objemu krve matky a plodu se pak použijí k výpočtu objemu FMH. Test KB je ovlivněn manipulací se vzorky, závisí na technikovi a může být nepřesný, pokud objemy krve pacienta nebo krevní obraz nejsou podobné použitým standardním odhadům. Předpokládá se, že použití výšky a hmotnosti matky k odhadu objemu krve matky pro každého testovaného jednotlivce může zlepšit přesnost testování KB. Tato metoda není široce praktikována a nebyla ověřena v běžné těhotné populaci. Takto "opravená KB" si zaslouží další zkoumání.

Dalším testem, který byl zkoumán, aby se předešlo některým úskalím testování KB, je hodnocení hladin alfa-fetoproteinu v séru matky (AFP). Koncentraci AFP pocházejícího z plodu v mateřském oběhu lze použít k odhadu objemu FMH. Vzhledem k tomu, že se hladiny AFP během těhotenství a mezi nimi liší, je testování AFP nejužitečnější, když se porovnává více hladin získaných v průběhu těhotenství. Naprostá většina těhotných žen ve Spojených státech podstupuje testování AFP ve druhém trimestru jako součást „čtyřnásobného“ nebo „trojitého“ screeningového testu na fetální aneuploidii a defekty neurální trubice. Ačkoli je to teoreticky životaschopné, žádné publikované zprávy nedokumentují použití této základní úrovně AFP ve druhém trimestru pro detekci FMH po dalším testování AFP blíže k termínu.

Dosud vyvinutého nejpřesnějšího měření FMH je dosaženo průtokovou cytometrií (FC) s použitím protilátek specifických pro hemoglobin fetálních buněk. Buňky musí být chemicky propustné, aby bylo umožněno vystavení FC protilátky intracelulárnímu hemoglobinu před analýzou. Navíc bylo prokázáno, že FC využívající monoklonální protilátky proti fetálnímu hemoglobinu spolehlivě diagnostikuje FMH > 0,1 % v obecné klinické populaci. To je méně citlivé než KB test, když se provádí za standardních klinických podmínek. Konečně, jak je v současné době praktikováno, FC s použitím protilátek proti fetálnímu hemoglobinu je časově náročné a drahé. Tento test proto není v současné době vhodný pro screening ve velkém měřítku.

Nebyla publikována žádná série placentárních patologií souvisejících s FMH. Protože je FMH považováno za onemocnění placentárního selhání, systematický přehled placent u těhotenství postižených FMH by mohl osvětlit patogenezi tohoto typu placentární abnormality.

Fetomaternální krvácení je nedostatečně prozkoumaným onemocněním s významnou související morbiditou a mortalitou. Tato studie si klade za cíl identifikovat časné klinické prediktory onemocnění a vyvinout strategii automatického screeningu vhodnou pro široké použití. K úplnému řešení tohoto problému budou použity standardní epidemiologické techniky v kombinaci s adaptací stávajících laboratorních technik.

4. Metody: K dosažení těchto specifických cílů navrhujeme (1) otestovat naše automatizované laboratorní testovací postupy pro FMH a (2) pilotovat protokol využívající nové automatizované laboratorní testovací postupy k identifikaci párů novorozenců a matek postižených FMH za účelem identifikace. časných klinických prediktorů FMH. Toto je pilotní prospektivní vnořená případová-kontrolní studie.

Ve spolupráci s laboratoří Red Cell Physiology v New York Blood Center jsme vyvinuli prototyp automatizovaného testu pro FMH využívající zařízení pro průtokovou cytometrii a reagencie dostupné v New York Blood Center.

Pro tuto pilotní studii bude vybrán vzorek žen přijatých do porodnice Mount Sinai Medical Center. Způsobilými ženami budou ženy přijaté k termínovanému porodu (porod mezi 37. 0/7 a 41. 6/7 týdnem od poslední menstruace). Matky nesoucí plody se známou fetální anomálií budou vyloučeny. Ženy s preeklampsií nebo anomálií placentární implantace (accreta, abrupce) budou zahrnuty, protože tyto stavy mohou ohrozit těhotenství pro FMH, ale v současné době neindikují sledování těhotenství kvůli fetální anémii. Bude zahrnuto více těhotenství. Ženy, které nebudou schopny dokončit proces souhlasu z důvodu pravděpodobného překotného porodu, vážného porodního nepohodlí nebo úzkosti plodu vyžadující okamžitý porodnický zákrok, budou vyloučeny. Každá žena bude zařazena do studie před požadovaným odběrem krve před porodem a/nebo zavedením IV, aby bylo možné získat studijní vzorek krve s klinicky indikovanou flebotomií. Studijní vzorky budou uloženy pro dávkové testování vzorků ze sledovaných těhotenství.

Ne všechny ženy, které darují krev v rámci této studie, budou mít krev testovanou na příznaky FMH. Ačkoli bude před porodem odebráno 5 ml krve vhodným souhlasným ženám, testovány budou pouze vzorky těch, které byly vybrány pro naši stratifikovanou populaci vzorku na základě neonatálního hematokritu (HCT). Veškerá odebraná mateřská krev bude ihned po flebotomii fixována a/nebo zmražena pro pozdější dávkovou analýzu.

Způsobilým novorozencům souhlasných matek bude odebráno 0,5 ml (přibližně 3 kapky) krve pro stanovení hematokritu v době požadovaného odběru krve pro New York State Newborn Screening Program v den dva života. Způsobilost bude určena nepřítomností jiné klinické anamnézy než FMH k vysvětlení neonatální anémie. Klinické indikátory anémie nesouvisející s FMH, které budou považovány za vylučovací kritéria, zahrnují hemolytické onemocnění (kvůli známé senzibilizaci Rh, Kell atd. nebo pozitivní Coombsův test), známou významnou kompresi míchy v době porodu (prolaps míchy, napjatá šňůra kolem krku nebo těla), transfuzní syndrom twin-to-twin uznaný jako anémie u dárcovského dvojčete a polycytémie u dvojčat příjemce a známá novorozenecká ztráta krve (neuzavřená pupeční šňůra, tržná rána). Novorozencům, kterým byl změřen hematokrit během prvních 48 hodin života pro klinickou indikaci, nebude pro tuto studii odebrána další krev; budou použity výsledky klinicky indikovaných vzorků. Všichni novorozenci zapsaných matek budou mít test HCT. Všechny páry matka-dítě s prokázanou neonatální anémií (HCT ≤ 50 %) budou zahrnuty do pilotní kohorty. V případě vícečetného těhotenství budou všichni sourozenci zahrnuti k analýze, pokud se u některého projeví anémie. Do pilotní kohorty bude zahrnuto také 25 procent novorozenců s HCT nad 50 % (každý čtvrtý subjekt studie s HCT > 50 %). Tato strategie odběru vzorků umožní vyhodnocení v celém spektru krevních obrazů novorozenců, které nadměrně zastupují osoby s anémií.

Mateřská krev subjektů studované kohorty podstupuje několik testů na FMH včetně FC, AFP a KB. Průtoková cytometrie bude provedena v New York Blood Center. Stanovení úrovně AFP a testování KB provede laboratoř nemocnice Mount Sinai.

Vzorky mateřské krve budou v době odběru vhodně fixovány, poté zmrazeny a každý týden dávkově testovány. Jakékoli klinicky indikované testování na FMH bude provedeno nezávisle na krevních vzorcích získaných po porodu a nebude zahrnuto do naší analýzy. Všechny dostupné výsledky testování AFP v prvním trimestru budou získány pro kohorty matek. Budou shromažďována antropometrická data pro správné výsledky testování pro odhadovaný objem krve matky na základě výšky a hmotnosti matky. Přesnost různých testovacích metod při predikci objemu fetální krve v mateřském oběhu bude stanovena porovnáním s KB vzorky korigovanými na skutečný spíše než odhadovaný objem mateřské krve.

Všechny placenty studovaných subjektů budou fixovány a drženy patologickou laboratoří po standardní jeden týden po porodu. Třicet těhotenství vybraných na základě stratifikovaného vzorku na základě závažnosti FMH bude mít těhotenskou placentu(y) podrobeny úplnému patologickému vyšetření. Budou použity standardní vyšetřovací techniky včetně hrubého a mikroskopického vyšetření.

Poté, co byly identifikovány matky ze studijní kohorty, shromáždíme lékařskou, sociální, environmentální a úplnou anamnézu těhotenství prostřednictvím řízeného rozhovoru. Prvky zvláštního zájmu budou zahrnovat ty, o nichž se v literatuře předpokládá, že jsou spojovány s FMH. Mezi faktory, o nichž se v literatuře v literatuře předpokládá, že jsou spojovány s FMH, patří hypertenze matky během těhotenství, preeklampsie matky, trauma matky během těhotenství, abrupce placenty a vícečetná gestace. Nástroj průzkumu prozkoumá tyto prvky mateřské anamnézy a provede široký průzkum environmentální a sociální historie ve snaze identifikovat nerozpoznané klinické prediktory FMH. Mateřské subjekty budou dotazovány během poporodního pobytu v nemocnici. Data budou použita pro identifikaci časných rizikových faktorů FMH.

Rizikové faktory budou identifikovány pomocí logistického regresního modelování s víceúrovňovým výsledkem, ve kterém je FMH kódována jako nepřítomná (referenční), mírná nebo závažná, což generuje samostatné poměry šancí pro mírnou a těžkou FMH. Alternativní laboratorní přístupy k identifikaci FMH budou porovnány zkoumáním shody pomocí kappa statistiky a kvantifikací shody napříč kategoriemi.