Выявление ранних предикторов фето-материнского кровотечения

1. Введение:

   Целью данного исследования является выявление кандидатов на клинические предикторы фетоматеринского кровотечения (FMH) и разработка стратегии скрининга для выявления беременностей, затронутых этим заболеванием, до того, как у плода возникнет тяжелая анемия.

   Фето-материнское кровотечение — это состояние, при котором плацентарный барьер разрушается, и плод «кровоточит» в материнский кровоток. При правильном функционировании плацента позволяет передавать питательные вещества и отходы между матерью и плодом, сохраняя при этом клеточные компоненты крови раздельными. Нередко небольшие количества крови плода попадают в кровоток матери без неблагоприятного воздействия на плод. Фактически, легкая форма FMH может быть обнаружена в 75% случаев нормальной беременности. Однако примерно в 3 из 1000 беременностей объем крови плода, перенесенный матери, вызывает у плода клинически значимую анемию. Анемия плода может вызвать значительную заболеваемость и смертность. У плодов, переживших тяжелую анемию, часто встречается пожизненная инвалидность.

   Диагноз FMH чаще всего ставится после неблагоприятного исхода для плода или новорожденного, что указывает на необходимость тестирования. Ранние факторы риска FMH неизвестны. Были предложены клинические предикторы FMH, но они не были подтверждены в ретроспективных исследованиях. Текущий стандарт тестирования на FMH, тест кислотного элюирования Kleihauer-Betke (KB), является трудоемким, длительным и, следовательно, дорогим. Кроме того, тест KB зависит от наблюдателя, и на него могут существенно повлиять изменения в подготовке образца. Не существует протокола скрининга FMH с автоматическим лабораторным тестированием, подходящего для использования в общей популяции беременных.

   Конкретная цель: Определить соответствующий лабораторный протокол для диагностики фетоматеринского кровотечения с помощью проспективного исследования и провести пилотное исследование, предназначенное для определения ранних клинических предикторов легкого фетоматеринского кровотечения.

2. Предыстория и значение Фето-материнское кровотечение возникает, когда нарушается нормальный кровоток внутри плаценты и клеточные компоненты крови плода попадают в кровоток матери. Здоровая плацента обеспечивает перенос растворенных веществ между матерью и плодом, сохраняя при этом клеточные компоненты двух кровообращений раздельными. Плацентарный фильтр обычно «протекает» во время нормальной беременности, что приводит к попаданию небольших объемов цельной крови плода в материнский кровоток. Объемы крови плода менее 1 мл могут быть обнаружены до 75% беременностей. Этот объем кровопотери считается клинически незначимым для плода. Тяжелая ФМГ с большим объемом кровопотери от плода к матери встречается реже. Хотя точный объем переливания крови, необходимый для классификации FMH как «тяжелой», обсуждается, ясно, что значительное острое или хроническое кровотечение приводит к неблагоприятному перинатальному исходу. Оценки заболеваемости тяжелой FMH различаются, прежде всего потому, что не существует всесторонних эпидемиологических исследований этого состояния. Оценки, основанные на скрининге Rh-аллоиммунизации у Rho(d)-отрицательных женщин, показывают, что тяжелая ЗМГ возникает в 1-3 из 1000 беременностей, но на ее долю приходится почти 14% необъяснимых смертей плода. Большой объем FMH может привести к тяжелой анемии плода. Хотя анемия плода может проявляться внутриутробно водянкой плода или задержкой внутриутробного развития, чаще не бывает внешних признаков тяжелой анемии, связанной с FMH, до мертворождения, дистресса плода при родах или критического состояния новорожденного. Непосредственными последствиями тяжелой FMH для новорожденных, переживших роды, являются разрушительные заболевания, такие как персистенция фетального кровообращения, гиповолемический шок и гипоксически-ишемическая энцефалопатия. Конечные неблагоприятные исходы включают высокие показатели умственной отсталости, церебрального паралича, неврологического опустошения и смерти. Несмотря на эти последствия и предполагаемый недавний рост заболеваемости тяжелой ФМГ, ранние предикторы тяжелой ФМГ остаются неизвестными, и более чем в 80% случаев причину кровотечения установить не удается. Факторы риска матери или беременности, подходящие для раннего скрининга или диагностики тяжелой FMH у беременных в целом, не выяснены. , Если анемию плода от FMH выявить до родов, можно успешно управлять внутриутробным переливанием крови плоду и родоразрешением до начала родов. , Результаты лечения анемии плода трансфузиями плода, даже повторными трансфузиями плода, обнадеживают. Таким образом, эмпирические предикторы FMH обещают немедленное улучшение клинических исходов. Социальные и финансовые затраты как на начальную интенсивную терапию, так и на долгосрочную хроническую помощь детям с когнитивной и двигательной инвалидностью в результате FMH значительны. Существует значительная потребность в раннем выявлении риска и практической стратегии скрининга для снижения человеческих и экономических издержек тяжелой FMH.

Утвержденные клинические предикторы FMH включают уменьшение движений плода, синусоидальную прослеживаемость сердечного ритма плода и водянку плода. , Эти маркеры бесполезны для предотвращения неблагоприятных событий, связанных с FMH, поскольку каждый из них означает установленную тяжелую анемию плода. Материнские характеристики, которые, как предполагается, увеличивают риск FMH, включают гипертонию, отслойку плаценты, злоупотребление психоактивными веществами и травму. Они были оценены в ретроспективном исследовании мертворождений в исследовании 1999 года. Ни один из них не был значительно связан с FMH. Клинические характеристики с подозрением на связь с FMH были оценены в исследовании 2004 г. Rho(d)-отрицательных женщин. Только беременность близнецами была достоверно связана с FMH. Неизвестно, выше ли частота FMH при многоплодной беременности, чем при одноплодной беременности. Проспективных или ретроспективных эпидемиологических исследований FMH среди беременных в целом не публиковалось. Не существует эпидемиологического описания спектра (легкая, умеренная, тяжелая) FMH. Ни одна серия плацентарной патологии, взятая из случаев FMH, не была завершена.

В настоящее время, даже если беременные с риском, заслуживающие скрининга, выявляются до разрушительного исхода, лабораторное тестирование на FMH не является простым. Наиболее часто используемым лабораторным тестом для обнаружения и количественного определения объема крови плода в кровотоке матери является тест кислотного элюирования Клейхауэра-Бетке (KB). Реагенты для теста KB относительно недороги, но тест зависит от оператора и трудоемок, что делает его непривлекательным кандидатом для использования в расширенном скрининге. Тест основан на том факте, что кислотный элюент лизирует хрупкие материнские эритроциты, в то время как фетальный гемоглобин стабилизирует фетальные эритроциты. Материнскую кровь получают и подвергают воздействию кислотного элюента. Оставшиеся интактными фетальные клетки окрашивают и подсчитывают. Оценки общего объема крови матери и плода затем используются для расчета объема FMH. На тест KB влияет обращение с образцами, он зависит от техника и может быть неточным, если объемы крови пациента или анализы крови не соответствуют используемым стандартным оценкам. Предполагается, что использование роста и веса матери для оценки объема материнской крови для каждого тестируемого может повысить точность тестирования KB. Этот метод не получил широкого распространения и не был валидирован для беременных в целом. Такая «исправленная БЗ» требует дальнейшего изучения.

Дополнительный тест, который был изучен, чтобы избежать некоторых ловушек тестирования KB, - это оценка уровней материнского сывороточного альфа-фетопротеина (АФП). Концентрация АФП плода в кровотоке матери может быть использована для оценки объема FMH. Однако, поскольку уровни АФП различаются во время и между беременностями, тестирование АФП наиболее полезно, когда сравниваются несколько уровней, полученных в течение беременности. Подавляющее большинство беременных женщин в Соединенных Штатах проходят тестирование на АФП во втором триместре в рамках «четырех» или «тройных» скрининговых тестов на анеуплоидию плода и дефекты нервной трубки. Хотя теоретически это возможно, ни один из опубликованных отчетов не документирует использование этого базового уровня АФП во втором триместре для выявления FMH после дополнительного тестирования на АФП ближе к сроку.

Наиболее точное измерение FMH, разработанное на сегодняшний день, достигается с помощью проточной цитометрии (FC) с использованием антител, специфичных к гемоглобину фетальных клеток. Клетки должны быть химически проницаемы, чтобы обеспечить воздействие антитела FC на внутриклеточный гемоглобин перед анализом. Кроме того, ФК с использованием моноклональных антител к фетальному гемоглобину задокументировано только для надежной диагностики FMH> 0,1% в общей клинической популяции. Он менее чувствителен, чем тест KB, когда проводится в стандартных клинических условиях. Наконец, в настоящее время ФК с использованием антител к фетальному гемоглобину требует много времени и средств. Поэтому в настоящее время этот тест не подходит для крупномасштабного скрининга.

Не опубликовано ни одной серии плацентарной патологии, связанной с FMH. Поскольку ЗМГ считается заболеванием плацентарной недостаточности, систематический обзор плацент при беременностях, пораженных ЗМГ, может пролить свет на патогенез этого типа плацентарной аномалии.

Фето-материнское кровотечение является недостаточно изученным заболеванием со значительной ассоциированной заболеваемостью и смертностью. Это исследование направлено на выявление ранних клинических предикторов заболевания и разработку стратегии автоматизированного скрининга, подходящей для широкого применения. Для полного решения этой проблемы будут использоваться стандартные эпидемиологические методы в сочетании с адаптацией существующих лабораторных методов.

4. Методы. Для достижения этих конкретных целей мы предлагаем (1) протестировать наши автоматизированные процедуры лабораторного тестирования на FMH и (2) опробовать протокол с использованием новых автоматизированных процедур лабораторного тестирования для выявления пар новорожденный-мать, пораженных FMH, для идентификации. ранних клинических предикторов FMH. Это пилотное проспективное вложенное исследование случай-контроль.

В сотрудничестве с лабораторией физиологии эритроцитов в Нью-Йоркском центре крови мы разработали прототип автоматизированного анализа на FMH с использованием оборудования для проточной цитометрии и реагентов, доступных в Нью-Йоркском центре крови.

Для этого пилотного исследования будет выбрана удобная выборка женщин, допущенных к трудовому отделению Медицинского центра Маунт-Синай. Приемлемыми женщинами будут женщины, допущенные к срочным родам (роды между 37 0/7 и 41 6/7 неделями от последней менструации). Будут исключены матери, вынашивающие плод с известной аномалией развития плода. Будут включены женщины с преэклампсией или аномалиями прикрепления плаценты (приращение, отслойка), поскольку эти состояния могут подвергать беременность риску ЗМГ, но в настоящее время не требуют наблюдения беременных на предмет анемии плода. Будут включены несколько беременностей. Женщины, которые не могут завершить процесс получения согласия из-за вероятных стремительных родов, сильного дискомфорта при родах или дистресса плода, требующего немедленного акушерского вмешательства, будут исключены. Каждая женщина будет включена в исследование до необходимого дородового забора крови и/или внутривенного введения, чтобы можно было получить образец крови для исследования с помощью флеботомии по клиническим показаниям. Образцы для исследования будут сохранены для пакетного тестирования образцов интересующей беременности.

Не у всех женщин, которые сдают кровь в рамках этого исследования, кровь проверяют на признаки FMH. Несмотря на то, что 5 мл крови будет взято у соответствующих женщин, давших согласие, до родов, будут проверены только образцы тех, которые были отобраны для нашей стратифицированной выборки на основе неонатального гематокрита (HCT). Вся взятая материнская кровь будет зафиксирована и/или заморожена сразу после флеботомии для последующего группового анализа.

У соответствующих критериям новорожденных от матерей, давших согласие, будет взято 0,5 мл (примерно 3 капли) крови для определения гематокрита во время необходимого забора крови для программы скрининга новорожденных штата Нью-Йорк на второй день жизни. Право на участие будет определяться отсутствием истории болезни, кроме FMH, объясняющей анемию новорожденных. Клинические признаки анемии, не связанной с FMH, которые будут рассматриваться как критерии исключения, включают гемолитическую болезнь (из-за известной сенсибилизации резус-фактором, Келлом и т. д. или положительной пробы Кумбса), известное значительное сдавление пуповины во время родов (выпадение пуповины, натяжение пуповины вокруг шеи или тела), трансфузионный синдром от близнеца к близнецу, распознаваемый как анемия у близнеца-донора и полицитемия у близнеца-реципиента, и известная неонатальная кровопотеря (непережатая пуповина, разрывы). У новорожденных, у которых гематокрит измеряется в течение первых 48 часов жизни по клиническим показаниям, дополнительный забор крови для этого исследования не проводится; будут использованы результаты клинически показанных образцов. Всем новорожденным матерей, включенных в программу, будет проведен тест на HCT. Все пары мать-ребенок с продемонстрированной неонатальной анемией (HCT ≤ 50%) будут включены в пилотную когорту. В случае многоплодной беременности все братья и сестры будут включены в анализ, если у кого-то из них будет обнаружена анемия. Двадцать пять процентов новорожденных с HCT более 50% также будут включены в пилотную группу (каждый четвертый субъект исследования с HCT > 50%). Эта стратегия выборки позволит провести оценку по всему спектру показателей крови новорожденных, в большей степени представляя тех, у кого анемия.

Кровь матерей исследуемой когорты подвергается нескольким тестам на FMH, включая FC, AFP и KB. Проточная цитометрия будет проводиться в Нью-Йоркском центре крови. Определение уровня АФП и тестирование на КБ будет проводиться в лаборатории больницы Маунт-Синай.

Образцы материнской крови должным образом фиксируются во время сбора, затем замораживаются и еженедельно тестируются партии. Любое клинически показанное тестирование на FMH будет проводиться независимо на образцах крови, полученных после родов, и не будет включено в наш анализ. Все доступные результаты тестирования на ОВП в первом триместре будут получены для когорты матерей. Будут собраны антропометрические данные для корректировки результатов тестирования расчетного объема материнской крови на основе роста и веса матери. Точность различных методов тестирования при прогнозировании объема крови плода в материнском кровотоке будет определяться путем сравнения с образцами KB, скорректированными на фактический, а не расчетный объем материнской крови.

Все плаценты испытуемых будут фиксироваться и храниться в лаборатории патологии в течение стандартной одной недели после родов. Тридцать беременностей, выбранных стратифицированной выборкой на основе тяжести FMH, будут иметь плаценту (плаценты) беременных, подвергнутую полному патологоанатомическому исследованию. Будут использоваться стандартные методы исследования, включая макроскопическое и микроскопическое исследование.

После того, как матери из исследуемой когорты будут определены, мы соберем медицинскую, социальную, экологическую и полную историю беременности посредством направленного интервью. Элементы, представляющие особый интерес, будут включать те, которые, как предполагается в литературе, связаны с FMH. Факторы, подозреваемые в литературе как связанные с FMH, включают артериальную гипертензию у матери во время беременности, преэклампсию у матери, травму матери во время беременности, отслойку плаценты и многоплодную беременность. Инструмент опроса исследует эти элементы материнского анамнеза, а также проводит широкий обзор экологического и социального анамнеза в попытке выявить непризнанные клинические предикторы FMH. Субъекты матери будут опрошены во время послеродового пребывания в больнице. Данные будут использованы для выявления ранних факторов риска FMH.

Факторы риска будут идентифицированы с помощью логистического регрессионного моделирования с многоуровневым исходом, в котором FMH кодируется как отсутствие (референтный), легкой или тяжелой степени, генерируя отдельные отношения шансов для легкой и тяжелой FMH. Альтернативные лабораторные подходы к идентификации FMH будут сравниваться путем изучения согласованности с использованием каппа-статистики и количественной оценки согласованности между категориями.