Identificação de Preditores Precoces de Hemorragia Fetomaterna

1. Introdução:

   O objetivo deste estudo é identificar candidatos a preditores clínicos de hemorragia feto-materna (FMH) e elaborar uma estratégia de triagem para identificar gestações afetadas pela condição antes que o feto seja comprometido por anemia grave.

   A hemorragia feto-materna é uma condição na qual a barreira placentária falha e o feto "sangra" na circulação materna. Quando funciona corretamente, a placenta permite a transferência de nutrientes e resíduos entre a mãe e o feto, mantendo os componentes celulares do sangue separados. Não é incomum que pequenas quantidades de sangue fetal atinjam a circulação materna sem efeito adverso sobre o feto. De fato, a FMH leve pode ser detectada em até 75% das gestações normais. Em aproximadamente 3 em 1.000 gestações, no entanto, o volume de sangue fetal transferido para a mãe causa anemia clinicamente significativa no feto. A anemia fetal pode causar significativa morbidade e mortalidade. Em fetos que sobrevivem à anemia grave, é comum a incapacidade vitalícia.

   O diagnóstico de FMH é mais comumente feito após a ocorrência de um resultado adverso fetal ou neonatal, indicando a necessidade de testes. Os fatores de risco iniciais para FMH são desconhecidos. Preditores clínicos de FMH foram sugeridos, mas não foram comprovados em estudos retrospectivos. O padrão atual de teste de cuidado para FMH, o teste de eluição ácida de Kleihauer-Betke (KB), é trabalhoso e demorado e, portanto, caro. Além disso, o teste KB depende do observador e pode ser significativamente afetado por variações na preparação da amostra. Não existe nenhum protocolo de triagem para FMH com testes laboratoriais automatizados apropriados para uso na população geral de grávidas.

   Objetivo Específico: Identificar um protocolo laboratorial adequado para o diagnóstico de hemorragia feto-materna por estudo prospectivo e conduzir um estudo destinado a determinar preditores clínicos precoces de hemorragia feto-materna leve.

2. Antecedentes e significado A hemorragia fetal-materna ocorre quando o fluxo normal de sangue dentro da placenta é interrompido e os componentes celulares do sangue fetal passam para a circulação materna. Uma placenta saudável permite a transferência de substâncias dissolvidas entre a mãe e o feto enquanto mantém separados os componentes celulares das duas circulações. É comum que o filtro placentário "vaze" durante a gravidez normal, resultando na transferência de pequenos volumes de sangue total fetal para a corrente sanguínea materna. Volumes de sangue fetal abaixo de 1 mL podem ser detectados em até 75% das gestações. Este volume de perda de sangue é considerado clinicamente insignificante para o feto. A FMH grave com grande volume de transferência de sangue do feto para a mãe é menos comum. Embora o volume exato de transferência de sangue necessário para classificar a FMH como "grave" seja debatido, está claro que uma hemorragia aguda ou crônica significativa leva a resultados perinatais adversos. As estimativas da incidência de FMH grave variam, principalmente porque não existem estudos epidemiológicos abrangentes sobre a condição. Estimativas baseadas na triagem para aloimunização Rh em mulheres Rho(d) negativas sugerem que a HFM grave ocorre em 1-3 de 1.000 gestações, mas é responsável por quase 14% das mortes fetais inexplicáveis. A FMH de grande volume pode resultar em anemia fetal grave. Embora a anemia fetal possa se manifestar in utero com hidropisia fetal reconhecida ou restrição de crescimento intrauterino, mais comumente não há sinais externos de anemia grave relacionada à FMH antes do natimorto, sofrimento fetal no parto ou doença crítica neonatal. As sequelas imediatas da FMH grave para neonatos que sobrevivem ao parto incluem doenças devastadoras, como persistência da circulação fetal, choque hipovolêmico e encefalopatia hipóxico-isquêmica. Resultados prejudiciais finais incluem altas taxas de retardo mental, paralisia cerebral, devastação neurológica e morte. Apesar dessas consequências e de uma suspeita de aumento recente na incidência de FMH grave, os preditores iniciais de FMH grave permanecem desconhecidos e nenhuma causa de hemorragia pode ser identificada em mais de 80% dos casos. Fatores de risco maternos ou de gravidez apropriados para triagem precoce ou diagnóstico de FMH grave na população grávida em geral não foram elucidados. , Se identificada antes do parto, a anemia fetal por FMH pode ser controlada com sucesso por transfusão fetal intrauterina e parto antes do início do trabalho de parto. , Os resultados após o tratamento da anemia fetal com transfusão fetal, mesmo transfusão fetal repetida, são encorajadores. Assim, os preditores empíricos da FMH seriam uma promessa imediata para melhorar os resultados clínicos. O custo social e financeiro tanto dos cuidados intensivos iniciais quanto dos cuidados crônicos de longo prazo para crianças com deficiência cognitiva e motora resultante da FMH é substancial. Existe uma necessidade considerável de identificação precoce de riscos e uma estratégia de triagem prática para mitigar os custos humanos e econômicos da FMH grave.

Preditores clínicos validados de FMH incluem diminuição do movimento fetal, traçado da frequência cardíaca fetal sinusoidal e hidropisia fetal. , Esses marcadores não são úteis para a prevenção de eventos adversos decorrentes da FMH, pois cada um significa anemia fetal grave estabelecida. As características maternas que supostamente aumentam o risco de FMH incluem hipertensão, descolamento prematuro da placenta, abuso de substâncias e trauma. Estes foram avaliados em estudo retrospectivo de natimortos em um estudo de 1999. Nenhum foi significativamente associado com FMH. As características clínicas com suspeita de associação com FMH foram avaliadas em um estudo de 2004 de mulheres Rho(d)-negativas. Apenas a gestação gemelar foi significativamente associada à FMH. Não se sabe se a incidência de FMH em gestações múltiplas é maior do que em gestações únicas. Nenhum levantamento epidemiológico prospectivo ou retrospectivo da FMH na população geral de gestantes foi publicado. Não existe descrição epidemiológica sobre o espectro (leve, moderado, grave) da FMH. Nenhuma série de patologia placentária extraída de casos de FMH foi concluída.

Atualmente, mesmo que gestações de risco dignas de triagem sejam identificadas antes do resultado devastador, os testes laboratoriais para FMH não são simples. O teste laboratorial mais utilizado para detectar e quantificar o volume de sangue fetal na circulação materna é o teste de eluição ácida de Kleihauer-Betke (KB). Os reagentes para o teste KB são relativamente baratos, mas o teste depende do operador e é trabalhoso, tornando-o um candidato desagradável para uso em triagem expandida. O teste é baseado no fato de que um eluente ácido irá lisar eritrócitos maternos frágeis enquanto a hemoglobina fetal estabiliza os eritrócitos fetais. O sangue materno é obtido e exposto ao eluente ácido. As células fetais intactas remanescentes são coradas e contadas. As estimativas do volume total de sangue materno e fetal são então usadas para calcular o volume de FMH. O teste KB é influenciado pelo manuseio da amostra, depende do técnico e pode ser impreciso se os volumes de sangue do paciente ou as contagens de sangue não forem semelhantes às estimativas padrão usadas. Supõe-se que usar altura e peso materno para estimar o volume de sangue materno para cada indivíduo testado pode melhorar a precisão do teste de KB. Este método não é amplamente praticado e não foi validado na população grávida em geral. Essa "KB corrigida" merece um exame mais aprofundado.

Um teste adicional que foi explorado para evitar algumas das armadilhas do teste de KB é a avaliação dos níveis de alfa-fetoproteína (AFP) sérica materna. A concentração de AFP derivada do feto na circulação materna pode ser usada para estimar o volume da FMH. Como os níveis de AFP variam durante e entre as gestações, no entanto, o teste de AFP é mais útil quando vários níveis obtidos ao longo da gravidez são comparados. A grande maioria das mulheres grávidas nos Estados Unidos são submetidas a testes de AFP no segundo trimestre como parte dos testes de triagem "quad" ou "triplos" para aneuploidia fetal e defeitos do tubo neural. Embora teoricamente viável, nenhum relatório publicado documenta o uso desse nível basal de AFP no segundo trimestre para detectar FMH após testes adicionais de AFP mais próximos do termo.

A medição mais precisa da FMH desenvolvida até o momento é obtida com citometria de fluxo (CF) usando anticorpos específicos para a hemoglobina das células fetais. As células devem ser permeáveis ​​quimicamente para permitir a exposição do anticorpo FC à hemoglobina intracelular antes da análise. Além disso, FC usando anticorpos monoclonais para hemoglobina fetal só foi documentado para diagnosticar com segurança FMH > 0,1% na população clínica geral. Isso é menos sensível do que o teste KB quando realizado em condições clínicas padrão. Finalmente, conforme praticado atualmente, a CF usando anticorpos para a hemoglobina fetal é demorada e cara. Este teste, portanto, não é apropriado para triagem em larga escala neste momento.

Nenhuma série de patologia placentária relacionada à FMH foi publicada. Como a FMH é considerada uma doença de falência placentária, uma revisão sistemática das placentas de gestações afetadas pela FMH poderia iluminar a patogênese desse tipo de anormalidade placentária.

A hemorragia feto-materna é uma entidade patológica pouco estudada com significativa morbilidade e mortalidade associadas. Este estudo visa identificar preditores clínicos precoces da doença e desenvolver uma estratégia de triagem automatizada apropriada para uso generalizado. Técnicas epidemiológicas padrão serão usadas em combinação com a adaptação de técnicas laboratoriais existentes para resolver completamente este problema.

4. Métodos: Para abordar esses objetivos específicos, propomos (1) testar nossos procedimentos de testes laboratoriais automatizados para FMH e (2) testar um protocolo piloto usando os novos procedimentos de testes laboratoriais automatizados para identificar pares neonato-mãe afetados por FMH para identificação de preditores clínicos precoces de FMH. Este é um estudo piloto prospectivo de caso-controle aninhado.

Em colaboração com o laboratório de Fisiologia de Células Vermelhas do New York Blood Center, desenvolvemos um protótipo de ensaio automatizado para FMH usando instalações de citometria de fluxo e reagentes disponíveis no New York Blood Center.

Uma amostra de conveniência de mulheres admitidas no chão de trabalho do Mount Sinai Medical Center será selecionada para este estudo piloto. Mulheres elegíveis serão aquelas admitidas para parto a termo (parto entre 37 0/7 e 41 6/7 semanas a partir do último período menstrual). Serão excluídas mães portadoras de fetos com anomalia fetal conhecida. Mulheres com pré-eclâmpsia ou anomalia de implantação placentária (acreta, descolamento) serão incluídas, pois essas condições podem colocar a gravidez em risco de FMH, mas atualmente não indicam vigilância da gravidez para anemia fetal. Gestações múltiplas serão incluídas. As mulheres incapazes de concluir o processo de consentimento devido a provável parto precipitado, desconforto grave no parto ou sofrimento fetal que requerem intervenção obstétrica imediata serão excluídas. Cada mulher será inscrita no estudo antes da coleta de sangue anteparto necessária e/ou colocação IV, de modo que uma amostra de sangue do estudo possa ser obtida com flebotomia clinicamente indicada. As amostras do estudo serão armazenadas para testes em lote das gestações de interesse.

Nem todas as mulheres que doam sangue como parte deste estudo terão seu sangue testado para sinais de FMH. Embora 5mL de sangue sejam colhidos de mulheres que consentem elegíveis antes do parto, apenas amostras daquelas selecionadas para nossa população de amostra estratificada com base no hematócrito neonatal (HCT) serão testadas. Todo o sangue materno coletado será fixado e/ou congelado imediatamente após a flebotomia para posterior análise em lote.

Recém-nascidos elegíveis de mães que consentiram terão 0,5 mL (aproximadamente 3 gotas) de sangue coletado para determinação do hematócrito no momento da coleta de sangue necessária para o Programa de Triagem Neonatal do Estado de Nova York no segundo dia de vida. A elegibilidade será determinada pela ausência de um histórico clínico diferente de FMH para explicar a anemia neonatal. Indicadores clínicos de anemia não relacionados à FMH que serão tratados como critérios de exclusão incluem doença hemolítica (devido a sensibilização conhecida de Rh, Kell, etc, ou teste de Coombs positivo), compressão significativa conhecida do cordão no momento do parto (cordão prolapsado, cordão apertado ao redor pescoço ou corpo), síndrome de transfusão entre gêmeos reconhecida como anemia no gêmeo doador e policitemia no gêmeo receptor e perda de sangue neonatal conhecida (cordão solto, laceração). Os recém-nascidos que tiverem o hematócrito medido nas primeiras 48 horas de vida para uma indicação clínica não terão sangue adicional coletado para este estudo; resultados de amostras clinicamente indicadas serão usados. Todos os recém-nascidos de mães inscritas farão o teste de HCT. Todos os pares mãe-bebê com anemia neonatal demonstrada (HCT ≤ 50%) serão incluídos na coorte piloto. No caso de gestação múltipla, todos os irmãos serão incluídos para análise caso algum apresente anemia. Vinte e cinco por cento dos recém-nascidos com HCT acima de 50% também serão incluídos na coorte piloto (a cada quarto sujeito do estudo com HCT > 50%). Essa estratégia de amostragem permitirá a avaliação em todo o espectro de hemogramas de recém-nascidos, super-representando aqueles com anemia.

O sangue materno dos indivíduos da coorte do estudo é submetido a vários testes para FMH, incluindo FC, AFP e KB. A citometria de fluxo será realizada no New York Blood Center. A determinação do nível de AFP e o teste de KB serão realizados pelo laboratório do Mount Sinai Hospital.

As amostras de sangue materno serão devidamente fixadas no momento da coleta, depois congeladas e testadas em lote semanalmente. Qualquer teste clinicamente indicado para FMH será realizado independentemente em amostras de sangue obtidas após o parto e não será incluído em nossa análise. Todos os resultados disponíveis do teste de AFP no primeiro trimestre serão obtidos para as mães da coorte. Os dados antropométricos serão coletados para corrigir os resultados dos testes para o volume de sangue materno estimado com base na altura e peso maternos. A precisão de vários métodos de teste para prever o volume de sangue fetal na circulação materna será determinada por comparação com as amostras de KB corrigidas para o volume de sangue materno real em vez do estimado.

Todas as placentas dos participantes do estudo serão fixadas e mantidas pelo laboratório de patologia por uma semana após o parto. Trinta gestações escolhidas por amostragem estratificada com base na gravidade da FMH terão a(s) placenta(s) gestacional(es) submetida(s) a um exame patológico completo. Técnicas de exame padrão, incluindo exame macroscópico e microscópico, serão usadas.

Depois que as mães da coorte do estudo forem identificadas, coletaremos o histórico médico, social, ambiental e completo da gravidez por meio de entrevista dirigida. Elementos de interesse particular incluirão aqueles hipotetizados na literatura como associados à FMH. Fatores suspeitos na literatura como associados à FMH incluem hipertensão materna durante a gravidez, pré-eclâmpsia materna, trauma materno durante a gravidez, descolamento prematuro da placenta e gestação múltipla. A ferramenta de pesquisa investigará esses elementos da história materna, bem como fará uma ampla pesquisa da história ambiental e social na tentativa de identificar preditores clínicos não reconhecidos de FMH. Os sujeitos maternos serão entrevistados durante a internação pós-parto. Os dados serão usados ​​para identificação de fatores de risco precoces de FMH.

Os fatores de risco serão identificados por meio de modelagem de regressão logística com um resultado multinível no qual a FMH é codificada como ausente (referente), leve ou grave, gerando razões de chance separadas para FMH leve e grave. As abordagens laboratoriais alternativas para a identificação da FMH serão comparadas examinando a concordância usando uma estatística kappa e quantificando a concordância entre as categorias.