Identificazione dei primi predittori di emorragia fetomaterna

1. Introduzione:

   L'obiettivo di questo studio è identificare i predittori clinici candidati di emorragia fetomaterna (FMH) e ideare una strategia di screening per identificare le gravidanze affette dalla condizione prima che il feto sia compromesso da grave anemia.

   L'emorragia fetomaterna è una condizione in cui la barriera placentare fallisce e il feto "sanguina" nella circolazione materna. Quando funziona correttamente, la placenta consente il trasferimento di nutrienti e rifiuti tra la madre e il feto, mantenendo separati i componenti cellulari del sangue. Non è raro che piccole quantità di sangue fetale raggiungano la circolazione materna senza effetti negativi sul feto. Infatti, FMH lieve può essere rilevato fino al 75% delle gravidanze normali. In circa 3 gravidanze su 1000, tuttavia, il volume di sangue fetale trasferito alla madre provoca anemia clinicamente significativa nel feto. L'anemia fetale può causare morbilità e mortalità significative. Nei feti che sopravvivono all'anemia grave, la disabilità permanente è comune.

   La diagnosi di FMH è più comunemente fatta dopo che si è verificato un esito avverso fetale o neonatale, indicando la necessità di test. I primi fattori di rischio per FMH non sono noti. Predittori clinici di FMH sono stati suggeriti, ma non sono stati confermati in uno studio retrospettivo. L'attuale test standard di cura per FMH, il test di eluizione acida di Kleihauer-Betke (KB), è laborioso e richiede tempo, e quindi costoso. Inoltre, il test KB dipende dall'osservatore e può essere notevolmente influenzato dalle variazioni nella preparazione del campione. Non esiste alcun protocollo di screening per FMH con test di laboratorio automatizzati appropriato per l'uso nella popolazione in gravidanza generale.

   Obiettivo specifico: identificare un protocollo di laboratorio appropriato per la diagnosi di emorragia fetomaterna mediante studio prospettico e pilotare uno studio inteso a determinare i predittori clinici precoci di emorragia fetomaterna lieve.

2. Sfondo e significato L'emorragia fetomaterna si verifica quando il normale flusso di sangue all'interno della placenta viene interrotto e le componenti cellulari del sangue fetale si incrociano nella circolazione materna. Una placenta sana permette il trasferimento delle sostanze disciolte tra madre e feto mantenendo separate le componenti cellulari delle due circolazioni. È comune che il filtro placentare "perda" durante le gravidanze normali, con conseguente trasferimento di piccoli volumi di sangue intero fetale nel flusso sanguigno materno. Volumi di sangue fetale inferiori a 1 ml possono essere rilevati fino al 75% delle gravidanze. Si ritiene che questo volume di perdita di sangue sia clinicamente insignificante per il feto. FMH grave con un grande volume di trasferimento di sangue dal feto alla madre è meno comune. Sebbene il volume esatto del trasferimento di sangue necessario per classificare l'FMH come "grave" sia dibattuto, è chiaro che un'emorragia acuta o cronica significativa porta a un esito perinatale avverso. Le stime dell'incidenza dell'FMH grave variano, principalmente perché non esistono studi epidemiologici completi sulla condizione. Le stime basate sullo screening per l'alloimmunizzazione Rh nelle donne Rho(d) negative suggeriscono che l'FMH grave si verifica in 1-3 gravidanze su 1000, ma rappresenta quasi il 14% delle morti fetali altrimenti inspiegabili. L'FMH di grande volume può provocare una grave anemia fetale. Sebbene l'anemia fetale possa manifestarsi in utero con idrope fetale riconosciuta o restrizione della crescita intrauterina, più comunemente non ci sono segni esteriori di anemia grave correlata all'FMH prima della morte del feto, sofferenza fetale al momento del parto o malattia critica neonatale. Le conseguenze immediate dell'FMH grave per i neonati che sopravvivono al parto includono malattie devastanti come la persistenza della circolazione fetale, lo shock ipovolemico e l'encefalopatia ipossico-ischemica. Gli esiti dannosi finali includono alti tassi di ritardo mentale, paralisi cerebrale, devastazione neurologica e morte. Nonostante queste conseguenze e un sospetto recente aumento dell'incidenza di FMH grave, i predittori precoci di FMH grave rimangono sconosciuti e nessuna causa di emorragia può essere identificata in oltre l'80% dei casi. I fattori di rischio materni o di gravidanza appropriati per lo screening precoce o la diagnosi di FMH grave nella popolazione generale in gravidanza non sono stati chiariti. Se identificata prima del parto, l'anemia fetale da FMH può essere gestita con successo mediante trasfusione fetale intrauterina e parto prima dell'inizio del travaglio. I risultati del trattamento dell'anemia fetale con trasfusioni fetali, anche ripetute, sono incoraggianti. Pertanto, i predittori empirici di FMH offrirebbero una promessa immediata per il miglioramento dei risultati clinici. Il costo sociale e finanziario sia della terapia intensiva iniziale che dell'assistenza cronica a lungo termine per i bambini con disabilità cognitiva e motoria derivanti dall'FMH è notevole. C'è un notevole bisogno di un'identificazione precoce del rischio e di una pratica strategia di screening per mitigare i costi umani ed economici dell'FMH grave.

Predittori clinici convalidati di FMH includono diminuzione del movimento fetale, tracciato della frequenza cardiaca fetale sinusoidale e idrope fetale. , Questi marcatori non sono utili per la prevenzione di eventi avversi derivanti da FMH poiché ciascuno indica una grave anemia fetale accertata. Le caratteristiche materne che si presume aumentino il rischio di FMH includono ipertensione, distacco della placenta, abuso di sostanze e traumi. Questi sono stati valutati in uno studio retrospettivo sui nati morti in uno studio del 1999. Nessuno era significativamente associato a FMH. Le caratteristiche cliniche con sospetta associazione con FMH sono state valutate in uno studio del 2004 su donne Rho(d)-negative. Solo la gestazione gemellare era significativamente associata a FMH. Non è noto se l'incidenza di FMH nelle gravidanze multiple sia superiore a quella delle gravidanze singole. Non è stata pubblicata alcuna indagine epidemiologica prospettica o retrospettiva sull'FMH nella popolazione generale in gravidanza. Non esiste una descrizione epidemiologica dello spettro (lieve, moderato, grave) dell'FMH. Nessuna serie di patologie placentari tratte da casi di FMH è stata completata.

Attualmente, anche se le gravidanze a rischio meritevoli di screening vengono identificate prima dell'esito devastante, i test di laboratorio per FMH non sono semplici. Il test di laboratorio più comunemente utilizzato per rilevare e quantificare il volume di sangue fetale nella circolazione materna è il test di eluizione acida di Kleihauer-Betke (KB). I reagenti per il test KB sono relativamente economici, ma il test dipende dall'operatore e richiede molta manodopera, il che lo rende un candidato poco attraente per l'uso nello screening esteso. Il test si basa sul fatto che un eluente acido liserà i fragili eritrociti materni mentre l'emoglobina fetale stabilizza gli eritrociti fetali. Il sangue materno viene prelevato ed esposto all'eluente acido. Le rimanenti cellule fetali intatte vengono colorate e contate. Le stime del volume ematico totale materno e fetale vengono quindi utilizzate per calcolare il volume di FMH. Il test KB è influenzato dalla manipolazione del campione, dipende dal tecnico e può essere impreciso se i volumi ematici o le conte ematiche del paziente non sono simili alle stime standard utilizzate. Si ipotizza che l'utilizzo dell'altezza e del peso materno per stimare il volume del sangue materno per ogni individuo testato possa migliorare l'accuratezza del test KB. Questo metodo non è ampiamente praticato e non è stato convalidato nella popolazione generale in gravidanza. Tale "KB corretto" merita un ulteriore esame.

Un ulteriore test che è stato esplorato per evitare alcune delle insidie ​​del test KB è la valutazione dei livelli di alfa-fetoproteina (AFP) nel siero materno. La concentrazione di AFP di origine fetale nella circolazione materna può essere utilizzata per stimare il volume di FMH. Poiché i livelli di AFP variano durante e tra le gravidanze, tuttavia, il test AFP è più utile quando vengono confrontati più livelli ottenuti nel corso della gravidanza. La stragrande maggioranza delle donne incinte negli Stati Uniti viene sottoposta a test AFP nel secondo trimestre come parte dei test di screening "quadruplo" o "triplo" per l'aneuploidia fetale e i difetti del tubo neurale. Sebbene teoricamente praticabile, nessun rapporto pubblicato documenta l'uso di questo livello basale di AFP del secondo trimestre per rilevare FMH dopo ulteriori test AFP più vicini al termine.

La misurazione più accurata di FMH sviluppata fino ad oggi si ottiene con la citometria a flusso (FC) utilizzando anticorpi specifici per l'emoglobina delle cellule fetali. Le cellule devono essere rese permeabili chimicamente per consentire l'esposizione dell'anticorpo FC all'emoglobina intracellulare prima dell'analisi. Inoltre, la FC che utilizza anticorpi monoclonali contro l'emoglobina fetale è stata documentata solo per diagnosticare in modo affidabile FMH> 0,1% nella popolazione clinica generale. Questo è meno sensibile del test KB se eseguito in condizioni cliniche standard. Infine, come attualmente praticato, la FC che utilizza anticorpi contro l'emoglobina fetale richiede tempo e denaro. Questo test non è quindi appropriato per lo screening su larga scala in questo momento.

Non è stata pubblicata alcuna serie di patologie placentari correlate all'FMH. Poiché si ritiene che l'FMH sia una malattia dell'insufficienza placentare, la revisione sistematica delle placente delle gravidanze affette da FMH potrebbe illuminare la patogenesi di questo tipo di anomalia placentare.

L'emorragia fetomaterna è un'entità patologica poco studiata con significativa morbilità e mortalità associate. Questo studio mira a identificare i predittori clinici precoci della malattia e a sviluppare una strategia di screening automatizzata appropriata per un uso diffuso. Le tecniche epidemiologiche standard saranno utilizzate in combinazione con l'adattamento delle tecniche di laboratorio esistenti per affrontare completamente questo problema.

4. Metodi: per affrontare questi obiettivi specifici, proponiamo (1) di testare le nostre procedure di analisi di laboratorio automatizzate per FMH e (2) di pilotare un protocollo utilizzando le nuove procedure di analisi di laboratorio automatizzate per identificare le coppie neonato-madre affette da FMH per l'identificazione dei predittori clinici precoci di FMH. Questo è uno studio caso-controllo nidificato prospettico pilota.

In collaborazione con il laboratorio Red Cell Physiology presso il New York Blood Center, abbiamo sviluppato un prototipo di test automatizzato per FMH utilizzando strutture di citometria a flusso e reagenti disponibili presso il New York Blood Center.

Per questo studio pilota verrà selezionato un campione di convenienza di donne ammesse al reparto travaglio del Mount Sinai Medical Center. Le donne idonee saranno quelle ricoverate per parto a termine (parto tra 37 0/7 e 41 6/7 settimane dall'ultimo periodo mestruale). Saranno escluse le madri portatrici di feti con anomalie fetali note. Saranno incluse le donne con pre-eclampsia o anomalia dell'impianto placentare (accreta, distacco), poiché queste condizioni possono mettere la gravidanza a rischio di FMH ma attualmente non indicano la sorveglianza della gravidanza per l'anemia fetale. Saranno incluse gravidanze multiple. Saranno escluse le donne che non sono in grado di completare il processo di consenso a causa di probabile parto precipitoso, grave disagio del travaglio o sofferenza fetale che richiedono un intervento ostetrico immediato. Ogni donna sarà arruolata nello studio prima del prelievo di sangue antepartum richiesto e/o posizionamento IV, in modo tale che un campione di sangue dello studio possa essere ottenuto con flebotomia clinicamente indicata. I campioni di studio saranno conservati per il test in batch di quelli provenienti da gravidanze di interesse.

Non tutte le donne che donano sangue nell'ambito di questo studio verranno sottoposte a esami del sangue per i segni di FMH. Sebbene 5 ml di sangue verranno prelevati da donne consenzienti idonee prima del parto, verranno testati solo i campioni di quelli selezionati per la nostra popolazione campione stratificata basata sull'ematocrito neonatale (HCT). Tutto il sangue materno prelevato verrà fissato e/o congelato immediatamente dopo la flebotomia per una successiva analisi in lotti.

I neonati idonei di madri consenzienti riceveranno 0,5 ml (circa 3 gocce) di sangue raccolto per la determinazione dell'ematocrito al momento del prelievo di sangue richiesto per il Programma di screening neonatale dello Stato di New York il secondo giorno di vita. L'ammissibilità sarà determinata dall'assenza di una storia clinica diversa da FMH per spiegare l'anemia neonatale. Gli indicatori clinici di anemia non correlata all'FMH che saranno trattati come criteri di esclusione includono la malattia emolitica (dovuta a sensibilizzazione Rh, Kell, ecc. del collo o del corpo), sindrome da trasfusione da gemello a gemello riconosciuta come anemia nel gemello donatore e policitemia nel gemello ricevente, e perdita di sangue neonatale nota (cordone aperto, lacerazione). I neonati che hanno l'ematocrito misurato entro le prime 48 ore di vita per un'indicazione clinica non riceveranno ulteriori prelievi di sangue per questo studio; verranno utilizzati i risultati dei campioni clinicamente indicati. Tutti i neonati di madri arruolate saranno sottoposti a test HCT. Tutte le coppie madre-bambino con anemia neonatale dimostrata (HCT ≤ 50%) saranno incluse nella coorte pilota. In caso di gestazione multipla, tutti i fratelli saranno inclusi per l'analisi se qualcuno dimostra anemia. Nella coorte pilota sarà incluso anche il 25% dei neonati con HCT superiore al 50% (ogni quarto soggetto dello studio con HCT > 50%). Questa strategia di campionamento consentirà la valutazione sullo spettro delle conte ematiche dei neonati, sovrarappresentando quelli con anemia.

Il sangue materno dei soggetti della coorte dello studio viene sottoposto a più test per FMH, inclusi FC, AFP e KB. La citometria a flusso verrà eseguita presso il New York Blood Center. La determinazione del livello di AFP e il test KB saranno eseguiti dal laboratorio del Mount Sinai Hospital.

I campioni di sangue materno verranno opportunamente fissati al momento della raccolta, quindi congelati e testati settimanalmente. Qualsiasi test clinicamente indicato per FMH verrà eseguito indipendentemente su campioni di sangue ottenuti dopo il parto e non sarà incluso nella nostra analisi. Tutti i risultati disponibili dei test AFP del primo trimestre saranno ottenuti per le madri di coorte. Verranno raccolti dati antropometrici per correggere i risultati dei test per il volume ematico materno stimato in base all'altezza e al peso materno. L'accuratezza dei vari metodi di analisi nella previsione del volume di sangue fetale nella circolazione materna sarà determinata confrontando i campioni KB corretti per il volume sanguigno materno effettivo piuttosto che stimato.

Tutte le placente dei soggetti dello studio saranno fissate e conservate dal laboratorio di patologia per la durata standard di una settimana dopo il parto. Trenta gravidanze scelte mediante campionamento stratificato in base alla gravità dell'FMH avranno la placenta (e) della gravidanza sottoposta a un esame patologico completo. Verranno utilizzate tecniche di esame standard, inclusi esami macroscopici e microscopici.

Dopo che le madri della coorte di studio sono state identificate, raccoglieremo la storia medica, sociale, ambientale e completa della gravidanza tramite intervista diretta. Elementi di particolare interesse includeranno quelli ipotizzati in letteratura per essere associati a FMH. I fattori sospettati in letteratura di essere associati all'FMH includono l'ipertensione materna durante la gravidanza, la preeclampsia materna, il trauma materno durante la gravidanza, il distacco della placenta e la gestazione multipla. Lo strumento di indagine indagherà questi elementi della storia materna oltre a condurre un'ampia indagine sulla storia ambientale e sociale nel tentativo di identificare predittori clinici non riconosciuti di FMH. I soggetti materni saranno intervistati durante la degenza post-partum in ospedale. I dati saranno utilizzati per l'identificazione dei primi fattori di rischio di FMH.

I fattori di rischio saranno identificati attraverso modelli di regressione logistica con un risultato multilivello in cui l'FMH è codificato come assente (referente), lieve o grave, generando odds ratio separati per FMH lieve e grave. Gli approcci di laboratorio alternativi all'identificazione di FMH saranno confrontati esaminando l'accordo utilizzando una statistica kappa e quantificando l'accordo tra le categorie.