Imunoterapie mozkových metastáz z rakoviny prsu na bázi proteomu

Studie bude zahrnovat 60 případů refrakterních mozkových metastáz z rakoviny prsu (BMBC) různé malignity po minimálně jedné linii standardní chemoterapie a kompletním průběhu radioterapie.

První linie terapie BMBC zahrnuje alogenní hematopoetické kmenové buňky (HSC), dendritickou vakcínu (DV) a cytotoxické lymfocyty (CTL).

HSC se používají ke stimulaci individualizované adoptivní imunitní odpovědi, k toxickému ovlivnění nádorových buněk a k cílené regulaci nádorových kmenových buněk (TSC) za účelem potlačení jejich reprodukčního a proliferačního potenciálu. K získání HSC dostane dárce 8 subkutánních podání faktoru stimulujícího kolonie granulocytů (G-CSF) v intervalu 8-10 hodin po dobu 4 dnů. První tři dny je jednorázová dávka 2,5 mcg na 1 kg hmotnosti, poslední den se dávka zdvojnásobí. Kmenové buňky jsou sklizeny v den 5. Červené krvinky jsou odebrány centrifugací. Obsah buněčných markerů je hodnocen průtokovou cytometrií. Výsledek je hodnocen po obohacení cytokoncentrátu a odstranění zralých buněk a plazmy z něj. Přípravek je skladován ve zkumavkách po 4 ml s kryoprotektorem a 10% roztokem polyglucinu. Podíl kmenových buněk není menší než 0,5x106 CD34+ a podíl lymfocytů není menší než 0,5x109 na jedno podání.

Vzorek mozkového nádoru se získá pomocí stereotaxické/endoskopické/otevřené biopsie od všech pacientů zařazených do studie. Nádorové buňky (TC) a TSC jsou imunochemicky izolovány ze vzorku biopsie BMBC. Jedna část vzorku nádoru je použita pro standardní histologické, cytologické a imunochemické vyšetření, zatímco z druhé části jsou izolovány nádorové buňky (TC) a nádorové kmenové buňky (TSC) (CD44+, CD24-/LowLin-).

Dendritické buňky se izolují z mononukleárních buněk periferní krve a kultivují se. Vzorek nádoru poskytuje nádorově specifické antigeny pro přípravu dendritické vakcíny (DV).

Příprava CTL má za cíl zvýšit cytotoxický účinek na nádor díky velkému počtu cirkulujících CTL. Cytotoxické lymfocyty (CTL) se izolují z asi 100 ml periferní krve po 3 podáních DV a z nich se pěstují dendritické buňky (DC). Poté se opakovaně odebírá periferní krev a izolují se lymfocyty. CTL jsou kokultivovány s DC nabitými nádorovými antigeny (terapie první linie) nebo rekombinantními proteiny analogickými klíčovým onkospecifickým proteinům (terapie druhé linie) několikrát, aby se jejich počet rozšířil (108-109). Je detekován jejich imunofenotyp a CTL jsou kryokonzervovány. První stimulace CTL pomocí DC trvá 6-8 dní, druhá 2-4 dny, další 2 dny jsou lymfocyty stimulovány potřetí a počtvrté. A poté jsou přijaté lymfocyty stimulovány IL-2 po dobu 2 dnů.

Šest měsíců po dokončení terapie první linie se vyhodnotí účinnost a kohorta prokazující účinnost pokračuje v terapii, zatímco kohorta nevykazující žádnou účinnost bude pokračovat ve studii s terapií druhé linie.

Druhá linie terapie využívá DV s rekombinantními proteiny analogickými klíčovým onkospecifickým proteinům, autologní CTL a autologní HSC s modifikovaným proteomem.

Autologní HSC jsou přijímány od účastníka studie, jak bylo popsáno výše. Buněčný preparát HSC pro aktivní komparátorové rameno je získán z cytokoncentrátu autologních mononukleárních buněk periferní krve po mobilizaci, jak je specifikováno pro experimentální rameno. Nádorově specifické antigeny pro aktivní komparátorovou skupinu jsou poskytovány nádorovou tkání pacienta.

TC a TSC stejně jako HSC pacienta podstupují kompletní mapování transkriptomů a profilování genové exprese (CTMGEP) a mapování proteomů a profilování proteinů (PMPP). Klíčové (3 nebo 4 proteiny s maximální normalizovanou intenzitou) onkospecifické proteiny (OSP) jsou určeny podle proteomového testování TC, zatímco proteomové profilování TSC a použití databází protein-proteinových vztahů umožňuje detekci neovlivněných intracelulárních signálních transdukčních drah (ISTP). karcinogenezí a schopné regulace. Rovněž jsou detekovány membránové cíle receptoru pro ovlivnění těchto signálních drah (proteiny akceptorové membrány) a také proteiny, které jsou schopny je aktivovat (proteinové ligandy). CTMGEP TSC potvrzuje diagnostikovaný funkční ISTP. Matematické modelování CTMGEP a srovnání s Affymetrix GeneChip Data lidského genomu U133A Array odhalují perturbageny schopné chemicky indukovat HSC a modifikovat jejich proteomový profil za účelem zajištění sekrece požadovaných proteinových ligandů. Databázová analýza umožňuje pochopit, jak změny v genové expresi vyvolané nízkomolekulárním činidlem nebo mikro RNA korespondují se změnami pozorovanými ve zkoumaném profilu. Pokud je korespondence významná, předpokládá se, že agent nebo podobní agenti mohou iniciovat účinek. Pokud je antikorelace významná, předpokládá se, že agens iniciuje opačný účinek v modifikaci genové exprese. Transkriptom HSC je modifikován kokultivací mononukleárních buněk s perturbageny. Jejich biologická účinnost je hodnocena in vitro v bioreaktoru Homunculus. Poté se příprava uloží, jak bylo popsáno výše.

Individuální DV se připravuje z leukokoncentrátu periferní krve pacienta. Lymfocyty jsou izolovány, kultivovány s G-CSF a interleukinem-2, kondicionovány nádorově specifickými antigeny, TNF-a a PGE2 po dobu 48 hodin a naplněny rekombinantními proteiny identickými s klíčovými nádorově specifickými antigeny detekovanými při proteomickém testování TC. Základním mechanismem individuálního imunitního účinku DN je tvorba nádorově toxických lymfocytů organismem pacienta.

CTL se získají tak, jak bylo popsáno dříve. Zásah je popsán v příslušné části.

Toxicita bude hodnocena podle kritérií CTC-NCI. Účinnost se hodnotí podle následujících kritérií:

1. Úplný účinek - úplné vymizení všech nádorových ložisek
2. Částečný efekt – zmenšení velikosti nádoru a/nebo metastatických ložisek nejméně o 50 % a žádné známky nových novotvarů
3. Stabilizace – zmenšení velikosti nádorových ložisek o méně než 50 % a bez známek nových novotvarů
4. Progrese - růst nádorových ložisek během terapie. V případě mozaikového efektu, kdy část ložisek progreduje a část je stabilní nebo redukující, terapie pokračuje, ale případy jsou analyzovány mimo kontext "Reakce na terapii"