Klinická validace Ramanova spektroskopu ke stanovení obsahu tuku v játrech

V současné době existují tři hlavní metody hodnocení jaterní steatózy před odběrem jater od mrtvého dárce: neinvazivní zobrazovací techniky, hodnocení vzorku jaterní biopsie zkušeným patologem a hodnocení transplantačním chirurgem.

Mezi zobrazovací techniky, které se v současnosti používají, patří ultrasonografie (USG), počítačová tomografie (CT) a zobrazování magnetickou rezonancí (MRI). Ačkoli má přijatelnou úroveň citlivosti, USG neposkytuje reprodukovatelné kvantitativní informace. Lze jej použít ve většině středisek, ale závisí na operátorovi. Stejně tak je nespolehlivý diagnostický výkon nezdokonaleného CT vyšetření pro přesnou kvantifikaci steatózy. MRI je vysoce citlivá a specifická při diagnostice jaterní steatózy a bylo hlášeno, že kvantifikace tuku pomocí 3,0-T MRI může poskytnout dostatečnou citlivost pro detekci a kvantifikaci steatózy u živých kandidátů na dárce jater. Tato složitá technologie však omezuje její použití při běžném odběru orgánů.

Zlatým standardem pro hodnocení steatózy je mikroskopické hodnocení vzorku jaterní biopsie odborným patologem. Přítomnost a typ steatózy lze určit mikroskopickým hodnocením. Stupeň steatózy lze určit podle mezinárodních standardů.

Přestože jde o zlatý standard, biopsie jsou zaznamenány pouze u 23 % transplantovaných jater ve Spojených státech. Vzhledem k tomu, že patolog není v době odběru vždy k dispozici, spoléhá mnohá centra hlavně na posouzení steatózy a kvality orgánu chirurgem provádějícím odběr (tj. transplantační chirurg). Během tohoto hodnocení se játra dárce hodnotí podle kritérií struktury parenchymu, jako je stupeň zežloutnutí (normální, mírný, střední, závažný) a stupeň pevnosti (měkký, normální; mírný, střední, závažný). Studie, které zkoumaly, jak přesně může transplantační chirurg předpovídat steatózu jater, však dospěly k závěru, že tato hodnocení mohou být významně zavádějící i ve zkušených rukou.

Protože všechny tyto tři metody mají svá omezení, existuje potřeba pohodlné a jednoduché techniky pro lepší hodnocení obsahu tuku v játrech před transplantací. Ramanova spektroskopie je technika neelastického rozptylu světla, která je citlivá na molekulární vibrace, jejichž symetrie a frekvence jsou jedinečné pro typ atomů a jejich prostorové uspořádání. Citlivost na tyto vlastnosti je základem jeho schopnosti poskytnout spektrální otisk molekul v osvětlené oblasti. Byl použit k detekci aminokyselin, nukleotidových bází, mastných kyselin, sacharidů, primárních metabolitů a dalších složek, které tvoří bílkoviny, sacharidy, tuky a DNA/RNA biologických tkání. Je to atraktivní technologie pro bioanalýzu, protože není potřeba žádná příprava vzorku.

Ramanova spektroskopie je v současné době zkoumána pro použití v klinických podmínkách a je prováděna hlavně pro diagnostické účely. V současné době je schválen pro použití v Kanadě pro diagnostiku rakoviny kůže.

Existuje celá řada různých systémů Ramanovy spektroskopie. Nedávno jsme navrhli vysoce výkonný Ramanův spektroskopický systém, který je menší než ostatní, přenosný a robustní. Umožňuje provádět skenování tkáně in situ s velmi malými zkušenostmi požadovanými od operátora. Tento systém využívá vlnovou délku excitace v blízké infračervené oblasti (NIR), aby zlepšil hloubku průniku laseru a zároveň snížil možnost poškození tkáně. Poskytuje informace ve formě Ramanových spekter, jejichž analýza dává skóre hlavní složky (PC).

Tento speciálně navržený systém by mohl přesně kvantifikovat steatózu u myší a krysích jater. PC skóre vykazovalo významnou korelaci s výsledky histopatologického vyšetření. Protože steatóza v lidské jaterní tkáni vykazuje změny podobné jako u levého jaterního laloku myší a potkanů, dospěli jsme k závěru, že tato technika by mohla být aplikována na oblast transplantací. Klinická validace a následné přijetí této techniky může poskytnout transplantačním specialistům cenný nástroj k získání informací v reálném čase o závažnosti jaterní steatózy, aby mohli posoudit pravděpodobnost úspěšného výsledku a snížit míru neúmyslného vyřazení orgánů.

CÍL Cílem této studie je ověřit Ramanovu spektroskopii (pomocí našeho speciálně navrženého vysoce výkonného Ramanova systému z optických vláken) v klinickém prostředí při hodnocení obsahu tuku v játrech. In vivo Ramanova spektra (PC skóre) budou porovnána s výsledky předoperační zobrazovací metody (MRI-kvantifikace tuku) a současným zlatým standardem, jaterní biopsií (tj. histopatologické vyšetření vzorku jater).

KONKRÉTNÍ VÝZKUMNÉ OTÁZKY

1. Může Ramanova spektroskopie využívající přenosný systém optických vláken rychle vyhodnotit obsah tuku v játrech in situ v klinickém prostředí? 2. Korelují Ramanova spektra (skóre hlavních složek) dobře s výsledky MRI-kvantifikace tuku a histopatologickým hodnocením vzorku jaterní biopsie? NÁVRH STUDIE: Tato studie je koncipována jako jednocentrická, prospektivní validační studie.

METODY Částečná resekce jater je chirurgické odstranění části jater. Většina částečných jaterních resekcí se provádí pro léčbu jaterních novotvarů. Pacienti, kteří podstoupí otevřenou parciální resekci jater v našem zařízení, budou posouzeni s kruhem pečovatelského týmu a požádáni o souhlas, pokud to bude považováno za vhodné pro tuto studii.

Při diskusi o souhlasu (provozované klinickým pracovníkem nebo výzkumným pracovníkem – oba jsou zkoušejícími účastnícími se tohoto projektu) bude použit formulář informovaného souhlasu schválený výborem pro etiku výzkumu Nového Skotska a pacientům bude poskytnut čas na přečtení dokumentu. dokument v plném rozsahu, než bude požádán o rozhodnutí o účasti. Pacienti, kteří dají souhlas se studií, budou zařazeni do studijní skupiny. Proces přidělování bude pokračovat, dokud nebude zahrnuto 25 pacientů.

Účastníci studie podstoupí předoperační MRI pro kvantifikaci tuku. Před MRI budou požádáni, aby se postili alespoň 8 hodin. Technika kvantifikace tuku (technika frakce tuku s protonovou hustotou) bude provedena pomocí pulzní sekvence IDEAL, která byla schválena Health Canada pro hodnocení frakce tuku v játrech, na jednotce 3,0-T MR (GE 750; GE Healthcare). Abdominální radiolog, který má zkušenosti s interpretací MR snímků, změří frakci jaterního tuku (FF) na FF mapách, které budou automaticky generovány. Automaticky vypočítaný jaterní FF se zobrazí v procentech na celé stupnici 0-100.

Během resekce jater bude oblast vzorku, která má být odstraněna, ale nikoli skutečná léze, osvětlena sondou z optického vlákna Ramanova spektroskopu. Poskytnutá a zaznamenaná Ramanova spektra v reálném čase (během několika sekund) budou následně analyzována (analýza hlavních složek). Tato analýza poskytne PC skóre.

Po aplikaci Ramanovy spektroskopie bude operační postup pokračovat podle plánu. Histochemická barviva, H&E (hematoxylin-eosin) a trichrom, se běžně používají pro interpretaci jaterních vzorků v naší anatomické patologické laboratoři. Jako speciální skvrnu bude nutné použít olejovou červeň O k prokázání přítomnosti a rozsahu tuku (tj. kvantifikace tuku) v jaterní tkáni. Vzhledem k tomu, že jej lze provést pouze na zmrazených řezech, bude z odebraného vzorku jater získán zmrazený řez, aby bylo možné provést specifické barvení Oil Red O pro diagnostiku a kvantifikaci tukových kapének. Ošetřující patolog, který je zaslepený k nálezům MRI, zhodnotí tyto řezy a určí stupeň steatózy podle mezinárodních standardů:

M0: žádná makrovezikulární steatóza M1: mírná fokální makrovezikulární steatóza (postiženo < 30 % hepatocytů) M2: středně těžká zonální makrovezikulární steatóza (postiženo > 30 a < 60 % hepatocytů) M3: těžká panlobulární makrovezikulární steatóza ( postiženo > 60 % hepatocytů) Pro každého účastníka studie bude provedena korelační analýza mezi procenty jaterního FF, PC skóre a stupni steatózy. Účastníci studie budou po operaci sledováni podle našeho standardního kontrolního protokolu po resekci jater bez jakýchkoli odchylek od standardu péče.

STATISTICKÁ ANALÝZA Pro statistickou analýzu budou kvantitativní data vyjádřena jako průměr a standardní odchylky a kvalitativní data budou vyjádřena jako čísla. Provede se lineární regrese mezi stupněm makrovezikulární steatózy a procenty jaterní FF a PC skóre. Křivky operačních charakteristik přijímače (ROC) budou generovány pro PC skóre a procenta jaterního FF, aby se identifikovala jejich schopnost předpovídat stupeň makrovezikulární steatózy. Veškeré statistické analýzy budou provedeny pomocí komerčně dostupného statistického softwaru (XLSTAT 2014).

Osobní zdravotní údaje nebudou použity pro realizaci tohoto projektu. Každému účastníkovi budou přidělena kódová čísla. Databáze, která bude přístupná pouze vyšetřovatelům, bude uložena v zabezpečeném počítači (vyžaduje zadání hesla) v transplantační kanceláři (centrum zdravotních věd královny Alžběty II, Victoria General Site, 4. patro, Dickson Building, místnost 4074). Tato databáze bude obsahovat kódová čísla účastníků a datové prvky, jako je procento jaterní FF, PC skóre a stupeň steatózy.