Validação clínica de um espectroscópio Raman para determinar o teor de gordura hepática

Atualmente, existem três métodos principais relatados para avaliar a esteatose hepática antes da recuperação do fígado de um doador falecido: técnicas de imagem não invasivas, avaliação de uma amostra de biópsia hepática por um patologista experiente e avaliação pelo cirurgião de transplante.

As técnicas de imagem atualmente em uso incluem ultrassonografia (USG), tomografia computadorizada (TC) e ressonância magnética (MRI). Embora tenha um nível aceitável de sensibilidade, a USG não fornece informações quantitativas reprodutíveis. Pode ser usado na maioria dos centros, mas depende do operador. Da mesma forma, o desempenho diagnóstico da tomografia computadorizada sem contraste para a quantificação precisa da esteatose não é confiável. A ressonância magnética é altamente sensível e específica no diagnóstico de esteatose hepática e foi relatado que a quantificação de gordura usando uma ressonância magnética de 3,0 T pode fornecer sensibilidade suficiente para detectar e quantificar a esteatose em candidatos a doadores vivos de fígado. No entanto, essa tecnologia complexa limita seu uso na aquisição de órgãos de rotina.

A avaliação microscópica de uma amostra de biópsia hepática por um patologista especialista é o padrão-ouro para avaliação da esteatose. A presença e o tipo de esteatose podem ser determinados por avaliação microscópica. O grau de esteatose pode ser determinado de acordo com os padrões internacionais.

Apesar de ser padrão-ouro, as biópsias são registradas em apenas 23% dos fígados transplantados nos Estados Unidos. Como um patologista nem sempre está disponível no momento da coleta, muitos centros dependem principalmente da avaliação da esteatose e da qualidade do órgão pelo cirurgião da coleta (ou seja, cirurgião de transplante). Durante esta avaliação, o fígado do doador é avaliado de acordo com critérios de textura do parênquima, como grau de amarelecimento (normal, leve, moderado, severo) e grau de firmeza (macio, normal; leve, moderado, severo). No entanto, estudos que investigaram com que precisão um cirurgião de transplante poderia prever a esteatose hepática concluíram que essas avaliações podem ser significativamente enganosas, mesmo em mãos experientes.

Uma vez que todos esses três métodos têm suas limitações, há necessidade de uma técnica conveniente e simples para avaliar melhor o conteúdo de gordura hepática antes do transplante. A espectroscopia Raman é uma técnica de dispersão de luz inelástica que é sensível a vibrações moleculares, cuja simetria e frequências são únicas para o tipo de átomos e seu arranjo espacial. A sensibilidade a essas propriedades é a base de sua capacidade de fornecer uma impressão digital espectral de moléculas na região iluminada. Tem sido usado para detectar aminoácidos, bases de nucleotídeos, ácidos graxos, sacarídeos, metabólitos primários e outros constituintes que formam a proteína, carboidratos, gorduras e DNA/RNA de tecidos biológicos. É uma tecnologia atraente para bioanálise porque não é necessária nenhuma preparação de amostra.

A espectroscopia Raman está atualmente sob investigação para uso em ambientes clínicos e é realizada principalmente para fins de diagnóstico. Atualmente, está aprovado para uso no Canadá para diagnóstico de câncer de pele.

Há uma variedade de diferentes sistemas de espectroscopia Raman. Recentemente, projetamos um sistema de espectroscopia Raman de alto rendimento que é menor que os outros, portátil e robusto. Ele permite que varreduras in situ de tecido sejam realizadas com muito pouca experiência exigida do operador. Este sistema usa o comprimento de onda de excitação do infravermelho próximo (NIR) para melhorar a profundidade de penetração do laser enquanto reduz a possibilidade de danos nos tecidos. Ele fornece informações na forma de espectros Raman, cuja análise fornece uma pontuação de Componente Principal (PC).

Este sistema especialmente projetado pode quantificar com precisão a esteatose em fígados de camundongos e ratos. Os escores de PC exibiram uma correlação significativa com os resultados do exame histopatológico. Como a esteatose no tecido hepático humano apresenta alterações semelhantes ao lobo esquerdo do fígado de camundongos e ratos, concluímos que esta técnica pode ser aplicada ao campo do transplante. A validação clínica e a subsequente adoção dessa técnica podem fornecer aos especialistas em transplante uma ferramenta valiosa para obter informações em tempo real sobre a gravidade da esteatose hepática para avaliar a probabilidade de um resultado bem-sucedido e reduzir as taxas de descarte inadvertido de órgãos.

OBJETIVO O objetivo deste estudo é validar a espectroscopia Raman (por meio de nosso sistema Raman de fibra óptica de alto rendimento especialmente projetado) em um ambiente clínico na avaliação do conteúdo de gordura hepática. Os espectros de Raman in vivo (escores de PC) serão comparados com os achados de um método de imagem pré-operatório (quantificação de gordura por ressonância magnética) e o padrão ouro atual, biópsia hepática (ou seja, avaliação histopatológica da amostra de fígado).

PERGUNTAS DE PESQUISA ESPECÍFICAS

1. A espectroscopia Raman utilizando um sistema portátil de fibra óptica pode avaliar rapidamente o conteúdo de gordura do fígado in situ em ambiente clínico? 2. Os espectros de Raman (escores de componentes principais) correlacionam-se bem com os achados da quantificação de gordura por RM e avaliação histopatológica do espécime de biópsia hepática? DESENHO DO ESTUDO: Este estudo foi concebido como um estudo de validação prospectivo de centro único.

MÉTODOS A ressecção parcial do fígado é a remoção cirúrgica de uma porção do fígado. A maioria das ressecções hepáticas parciais é realizada para o tratamento de neoplasias hepáticas. Os pacientes que serão submetidos a uma cirurgia de ressecção hepática parcial aberta em nossa instituição serão revisados ​​com a equipe do círculo de cuidados e abordados para consentimento, se considerados adequados para este estudo.

Um formulário de consentimento informado aprovado pelo Conselho de Ética em Pesquisa da Autoridade de Saúde da Nova Escócia será utilizado na discussão de consentimento (executado pelo colega clínico ou pelo associado de pesquisa - ambos os quais são investigadores participantes deste projeto) e os pacientes terão tempo para ler o documento na íntegra antes de ser solicitado uma decisão sobre a participação. Os pacientes que derem seu consentimento para o estudo serão designados para o grupo de estudo. O processo de designação continuará até que 25 pacientes sejam incluídos.

Os participantes do estudo serão submetidos a uma ressonância magnética pré-operatória para quantificação de gordura. Eles serão solicitados a jejuar por pelo menos 8 horas antes da ressonância magnética. A técnica de quantificação de gordura (técnica de fração de gordura com densidade de prótons) será realizada usando a sequência de pulso IDEAL, que foi aprovada pela Health Canada para avaliação da fração de gordura hepática, em uma unidade de ressonância magnética de 3,0 T (GE 750; GE Healthcare). Um radiologista abdominal treinado e com experiência em interpretação de imagens de RM medirá a fração de gordura hepática (FF) em mapas FF, que serão gerados automaticamente. O FF hepático calculado automaticamente será exibido como uma porcentagem em uma escala completa de 0-100.

Durante o procedimento de ressecção hepática, uma região da amostra a ser removida, mas não a lesão real, será iluminada pela sonda de fibra óptica do espectroscópio Raman. Os espectros Raman fornecidos e registrados em tempo real (em poucos segundos) serão posteriormente analisados ​​(análise de componentes principais). Essa análise fornecerá uma pontuação de PC.

Após a aplicação da espectroscopia Raman, o procedimento operatório continuará conforme planejado. Colorações histoquímicas, H&E (hematoxilina-eosina) e tricrômico, são rotineiramente usadas para a interpretação de amostras de fígado em nosso laboratório de anatomia patológica. Como uma mancha especial, o Oil Red O precisará ser usado para demonstrar a presença e a extensão da gordura (ou seja, quantificação de gordura) no tecido hepático. Uma vez que só pode ser realizada em secções congeladas, uma secção congelada será obtida a partir da secção da amostra de fígado removida para permitir a coloração Oil Red O específica para diagnosticar e quantificar gotículas de gordura. Um patologista assistente que não conhece os achados da ressonância magnética avaliará essas seções e determinará o grau de esteatose de acordo com os padrões internacionais:

M0: sem esteatose macrovesicular M1: esteatose macrovesicular focal leve (<30% dos hepatócitos estão envolvidos) M2: moderada, esteatose macrovesicular zonal (>30 e <60% dos hepatócitos envolvidos) M3: grave, esteatose macrovesicular panlobular (>60% dos hepatócitos envolvidos) A análise de correlação será realizada entre as porcentagens de FF hepáticas, escores de PC e graus de esteatose para cada participante do estudo. Os participantes do estudo serão acompanhados após a cirurgia de acordo com nosso protocolo de acompanhamento pós-ressecção hepática padrão sem quaisquer desvios do padrão de atendimento.

ANÁLISE ESTATÍSTICA Para análise estatística, os dados quantitativos serão expressos como médias e desvios padrão e os dados qualitativos serão expressos como números. A regressão linear será realizada entre o grau de esteatose macrovesicular e os percentuais de FF hepático e os escores de PC. Curvas de características operacionais do receptor (ROC) serão geradas para os escores de PC e porcentagens de FF hepáticas para identificar sua capacidade de prever o grau de esteatose macrovesicular. Todas as análises estatísticas serão realizadas com software estatístico disponível comercialmente (XLSTAT 2014).

Informações pessoais de saúde não serão usadas para a condução deste projeto. Números de código serão atribuídos a cada participante. Um banco de dados que será acessível apenas aos investigadores será armazenado em um computador seguro (exigindo entrada de senha) no escritório de transplante (Centro de Ciências da Saúde Queen Elizabeth II, Victoria General Site, 4º andar, Edifício Dickson, Sala 4074). Este banco de dados incluirá os números de código dos participantes e os elementos de dados como porcentagem de FF hepática, pontuação de PC e grau de esteatose.