Validación clínica de un espectroscopio Raman para determinar el contenido de grasa hepática

Actualmente, existen tres métodos principales informados para evaluar la esteatosis hepática antes de la recuperación del hígado de un donante fallecido: técnicas de imagen no invasivas, evaluación de una muestra de biopsia hepática por un patólogo experimentado y evaluación por un cirujano de trasplante.

Las técnicas de formación de imágenes que se utilizan actualmente incluyen ultrasonografía (USG), tomografía computarizada (CT) e imágenes por resonancia magnética (MRI). Aunque tiene un nivel aceptable de sensibilidad, USG no proporciona información cuantitativa reproducible. Se puede utilizar en la mayoría de los centros, pero depende del operador. Asimismo, el rendimiento diagnóstico de la tomografía computarizada sin contraste para la cuantificación precisa de la esteatosis no es confiable. La resonancia magnética es muy sensible y específica para diagnosticar la esteatosis hepática y se ha informado que la cuantificación de grasa mediante una resonancia magnética de 3,0 T puede proporcionar suficiente sensibilidad para detectar y cuantificar la esteatosis en candidatos a donantes vivos de hígado. Sin embargo, esta tecnología compleja limita su uso en la obtención rutinaria de órganos.

La evaluación microscópica de una muestra de biopsia hepática por parte de un patólogo experto es el estándar de oro para la evaluación de la esteatosis. La presencia y el tipo de esteatosis pueden determinarse mediante evaluación microscópica. El grado de esteatosis se puede determinar de acuerdo con los estándares internacionales.

A pesar de ser el estándar de oro, las biopsias se registran para solo el 23% de los hígados trasplantados en los Estados Unidos. Dado que un patólogo no siempre está disponible en el momento de la obtención, muchos centros confían principalmente en la evaluación de la esteatosis y la calidad del órgano por parte del cirujano encargado de la obtención (es decir, cirujano de trasplantes). Durante esta evaluación, el hígado del donante se evalúa de acuerdo con criterios de textura del parénquima, como el grado de amarilleamiento (normal, leve, moderado, severo) y el grado de firmeza (suave, normal; leve, moderado, severo). Sin embargo, los estudios que investigaron con qué precisión un cirujano de trasplante podría predecir la esteatosis hepática concluyeron que estas evaluaciones podrían ser significativamente engañosas incluso en manos experimentadas.

Dado que estos tres métodos tienen sus limitaciones, existe la necesidad de una técnica conveniente y simple para evaluar mejor el contenido de grasa hepática antes del trasplante. La espectroscopia Raman es una técnica de dispersión de luz inelástica que es sensible a las vibraciones moleculares, cuya simetría y frecuencias son únicas para el tipo de átomos y su disposición espacial. La sensibilidad a estas propiedades es la base de su capacidad para proporcionar una huella digital espectral de las moléculas en la región iluminada. Se ha utilizado para detectar aminoácidos, bases de nucleótidos, ácidos grasos, sacáridos, metabolitos primarios y otros constituyentes que forman las proteínas, los carbohidratos, las grasas y el ADN/ARN de los tejidos biológicos. Es una tecnología atractiva para el bioanálisis porque no se necesita preparación de muestras.

La espectroscopia Raman se encuentra actualmente bajo investigación para su uso en entornos clínicos y se lleva a cabo principalmente con fines de diagnóstico. Actualmente está aprobado para su uso en Canadá para el diagnóstico de cáncer de piel.

Hay una variedad de diferentes sistemas de espectroscopia Raman. Recientemente hemos diseñado un sistema de espectroscopia Raman de alto rendimiento que es más pequeño que los demás, portátil y robusto. Permite realizar escaneos in situ de tejido con muy poca experiencia requerida por parte del operador. Este sistema utiliza una longitud de onda de excitación del infrarrojo cercano (NIR) para mejorar la profundidad de penetración del láser y reducir al mismo tiempo la posibilidad de daño tisular. Proporciona información en forma de espectros Raman, cuyo análisis proporciona una puntuación de componente principal (PC).

Este sistema especialmente diseñado podría cuantificar con precisión la esteatosis en hígados de ratones y ratas. Las puntuaciones de PC exhibieron una correlación significativa con los resultados del examen histopatológico. Dado que la esteatosis en el tejido hepático humano presenta cambios similares a los del lóbulo hepático izquierdo de ratones y ratas, concluimos que esta técnica podría aplicarse al campo de los trasplantes. La validación clínica y la posterior adopción de esta técnica pueden proporcionar a los especialistas en trasplantes una herramienta valiosa para obtener información en tiempo real sobre la gravedad de la esteatosis hepática para evaluar la probabilidad de un resultado exitoso y reducir las tasas de descarte inadvertido de órganos.

OBJETIVO El objetivo de este estudio es validar la espectroscopia Raman (por medio de nuestro sistema Raman de fibra óptica de alto rendimiento especialmente diseñado) en un entorno clínico en la evaluación del contenido de grasa hepática. Los espectros Raman in vivo (puntuaciones de PC) se compararán con los hallazgos de un método de imagen preoperatorio (cuantificación de grasa por resonancia magnética) y el estándar de oro actual, la biopsia hepática (es decir, evaluación histopatológica de la muestra de hígado).

PREGUNTAS ESPECÍFICAS DE INVESTIGACIÓN

1. ¿Puede la espectroscopia Raman que utiliza un sistema de fibra óptica portátil evaluar rápidamente el contenido de grasa del hígado in situ en un entorno clínico? 2. ¿Los espectros Raman (puntuaciones de los componentes principales) se correlacionan bien con los resultados de la cuantificación de grasa por resonancia magnética y la evaluación histopatológica de la muestra de biopsia hepática? DISEÑO DEL ESTUDIO: Este estudio se concibe como un estudio de validación prospectivo de un solo centro.

MÉTODOS La resección hepática parcial es la extirpación quirúrgica de una porción del hígado. La mayoría de las resecciones hepáticas parciales se realizan para el tratamiento de neoplasias hepáticas. Los pacientes que se someterán a una cirugía de resección hepática parcial abierta en nuestra institución serán revisados ​​con el equipo del círculo de atención y se les pedirá su consentimiento si se considera adecuado para este estudio.

En la discusión del consentimiento se utilizará un formulario de consentimiento informado aprobado por la Junta de Ética en Investigación de la Autoridad de Salud de Nueva Escocia (dirigido por el becario clínico o el investigador asociado, quienes son investigadores que participan en este proyecto) y los pacientes tendrán tiempo para leer el documento en su totalidad antes de que se le solicite una decisión sobre la participación. Los pacientes que den su consentimiento para el estudio serán asignados al grupo de estudio. El proceso de asignación continuará hasta que se incluyan 25 pacientes.

Los participantes del estudio se someterán a una resonancia magnética preoperatoria para la cuantificación de grasa. Se les pedirá que ayunen durante al menos 8 horas antes de la resonancia magnética. La técnica de cuantificación de grasa (técnica de fracción de grasa de densidad de protones) se realizará utilizando la secuencia de pulso IDEAL, que ha sido aprobada por Health Canada para la evaluación de la fracción de grasa hepática, en una unidad de RM de 3,0 T (GE 750; GE Healthcare). Un radiólogo abdominal capacitado en beca que tenga experiencia en la interpretación de imágenes de RM medirá la fracción de grasa hepática (FF) en mapas de FF, que se generarán automáticamente. El FF hepático calculado automáticamente se mostrará como un porcentaje en una escala completa de 0-100.

Durante el procedimiento de resección hepática, la sonda de fibra óptica del espectroscopio Raman iluminará una región de la muestra que se va a extraer, pero no la lesión real. Los espectros Raman proporcionados y registrados en tiempo real (en pocos segundos) serán posteriormente analizados (análisis de componentes principales). Este análisis proporcionará una puntuación de PC.

Tras la aplicación de la espectroscopia Raman, el procedimiento quirúrgico continuará según lo previsto. Las tinciones histoquímicas, H&E (hematoxilina-eosina) y tricrómico, se utilizan de forma rutinaria para la interpretación de muestras de hígado en nuestro laboratorio de anatomía patológica. Como tinción especial, será necesario usar Oil Red O para demostrar la presencia y extensión de la grasa (es decir, cuantificación de grasa) en tejido hepático. Dado que solo se puede realizar en secciones congeladas, se obtendrá una sección congelada de la sección de la muestra de hígado extraída para permitir la tinción con Oil Red O, específica para diagnosticar y cuantificar las gotas de grasa. Un patólogo tratante que no conoce los hallazgos de la resonancia magnética evaluará estas secciones y determinará el grado de esteatosis según los estándares internacionales:

M0: sin esteatosis macrovesicular M1: esteatosis macrovesicular focal leve (<30 % de hepatocitos implicados) M2: esteatosis macrovesicular zonal moderada (>30 y <60 % de hepatocitos implicados) M3: esteatosis macrovesicular panlobulillar grave (>60 % de hepatocitos implicados) Se realizará un análisis de correlación entre los porcentajes de FF hepática, las puntuaciones de PC y los grados de esteatosis para cada participante del estudio. Los participantes del estudio serán seguidos después de la cirugía de acuerdo con nuestro protocolo estándar de seguimiento posterior a la resección hepática sin desviaciones del estándar de atención.

ANÁLISIS ESTADÍSTICO Para el análisis estadístico, los datos cuantitativos se expresarán como medias y desviaciones estándar y los datos cualitativos se expresarán como números. Se realizará una regresión lineal entre el grado de esteatosis macrovesicular y los porcentajes de FF hepática y puntuaciones de PC. Se generarán curvas de características operativas del receptor (ROC) para las puntuaciones de PC y los porcentajes de FF hepática para identificar su capacidad de predecir el grado de esteatosis macrovesicular. Todos los análisis estadísticos se realizarán con software estadístico comercialmente disponible (XLSTAT 2014).

La información de salud personal no se utilizará para la realización de este proyecto. Se asignarán números de código para cada participante. Una base de datos a la que solo tendrán acceso los investigadores se almacenará en una computadora segura (que requiere el ingreso de una contraseña) en la oficina de trasplantes (Centro de Ciencias de la Salud Queen Elizabeth II, Sitio General de Victoria, 4to piso, Edificio Dickson, Sala 4074). Esta base de datos incluirá los números de código de los participantes y elementos de datos como el porcentaje de FF hepática, la puntuación de PC y el grado de esteatosis.