Klinisk validering af et Raman-spektroskop til bestemmelse af hepatisk fedtindhold

I øjeblikket er der rapporteret tre hovedmetoder til at vurdere leversteatose før afdøde donorleverudvinding: Ikke-invasive billeddannelsesteknikker, evaluering af en leverbiopsiprøve af en erfaren patolog og vurdering af transplantationskirurg.

Billeddannelsesteknikker, der i øjeblikket er i brug, omfatter ultralyd (USG), computertomografi (CT) og magnetisk resonansbilleddannelse (MRI). Selvom det har et acceptabelt følsomhedsniveau, giver USG ikke reproducerbare kvantitative oplysninger. Den kan bruges i de fleste centre, men den er operatørafhængig. Ligeledes er den diagnostiske ydeevne af ikke-forstærket CT-scanning til nøjagtig kvantificering af steatose upålidelig. MR er meget sensitiv og specifik til at diagnosticere hepatisk steatose, og det er blevet rapporteret, at fedtkvantificering ved hjælp af en 3,0-T MR kan give tilstrækkelig følsomhed til at påvise og kvantificere steatose hos levende leverdonorkandidater. Imidlertid begrænser denne komplekse teknologi dens anvendelse i rutinemæssig organudtagning.

Den mikroskopiske evaluering af en leverbiopsiprøve af en ekspertpatolog er guldstandarden for steatosevurdering. Tilstedeværelsen og typen af ​​steatose kan bestemmes ved mikroskopisk evaluering. Graden af ​​steatose kan bestemmes i henhold til internationale standarder.

På trods af at de er guldstandard, registreres biopsier for kun 23% af de transplanterede lever i USA. Da en patolog ikke altid er tilgængelig på anskaffelsestidspunktet, er mange centre primært afhængige af vurderingen af ​​steatose og organkvalitet af anskaffelseskirurgen (dvs. transplantationskirurg). Under denne vurdering evalueres donorleveren i henhold til parenkymale teksturkriterier, såsom grad af gulhed (normal, mild, moderat, svær) og grad af fasthed (blød, normal; mild, moderat, svær). Imidlertid konkluderede undersøgelser, der undersøgte, hvor nøjagtigt en transplantationskirurg kunne forudsige leversteatose, at disse vurderinger kunne være betydeligt vildledende selv i erfarne hænder.

Da alle disse tre metoder har deres begrænsninger, er der behov for en bekvem og enkel teknik til bedre at vurdere leverfedtindholdet før transplantation. Raman-spektroskopi er en uelastisk lysspredningsteknik, der er følsom over for molekylære vibrationer, hvis symmetri og frekvenser er unikke for typen af ​​atomer og deres rumlige arrangement. Følsomhed over for disse egenskaber er grundlaget for dets evne til at give et spektralt fingeraftryk af molekyler i det belyste område. Det er blevet brugt til at påvise aminosyrer, nukleotidbaser, fedtsyrer, saccharider, primære metabolitter og andre bestanddele, der danner protein, kulhydrater, fedt og DNA/RNA i biologiske væv. Det er en attraktiv teknologi til bioanalyse, fordi der ikke er behov for prøveforberedelse.

Raman-spektroskopi er i øjeblikket under undersøgelse til brug i kliniske omgivelser, og den udføres hovedsageligt til diagnostiske formål. Det er i øjeblikket godkendt til brug i Canada til hudkræftdiagnose.

Der findes en række forskellige Raman-spektroskopisystemer. Vi har for nylig designet et Raman-spektroskopisystem med høj kapacitet, som er mindre end de andre, bærbart og robust. Det gør det muligt at udføre in situ-scanninger af væv med meget lidt erfaring, der kræves af operatøren. Dette system anvender 'nær infrarød (NIR) excitationsbølgelængde til at forbedre laserens indtrængningsdybde, mens det reducerer muligheden for vævsskade. Det giver information i form af Raman-spektre, hvis analyse giver en Principal Component (PC) score.

Dette specialdesignede system kunne nøjagtigt kvantificere steatose hos mus og rottelever. PC-resultaterne udviste en signifikant korrelation med histopatologiske undersøgelsesresultater. Da steatose i humant levervæv udviser ændringer svarende til venstre leverlap hos mus og rotter, konkluderede vi, at denne teknik kunne anvendes på transplantationsområdet. Klinisk validering og efterfølgende indførelse af denne teknik kan give transplantationsspecialister et værdifuldt værktøj til at opnå realtidsinformation om sværhedsgraden af ​​hepatisk steatose for at vurdere sandsynligheden for et vellykket resultat og reducere antallet af utilsigtede organudsmidninger.

MÅL Formålet med denne undersøgelse er at validere Raman-spektroskopi (ved hjælp af vores specialdesignede high-throughput fiberoptiske Raman-system) i kliniske omgivelser til vurdering af leverfedtindhold. In vivo Raman-spektrene (PC-score) vil blive sammenlignet med resultaterne af en præoperativ billeddannelsesmetode (MRI-fedtkvantificering) og den nuværende guldstandard, leverbiopsi (dvs. histopatologisk vurdering af leverprøven).

SPECIFIKKE FORSKNINGSSPØRGSMÅL

1. Kan Raman-spektroskopi ved hjælp af et bærbart fiberoptisk system hurtigt vurdere fedtindholdet i leveren in situ i kliniske omgivelser? 2. Korrelerer Raman-spektre (hovedkomponentscore) godt med resultaterne af MRI-fedtkvantificering og histopatologisk vurdering af leverbiopsiprøven? STUDIEDESIGN: Denne undersøgelse er tænkt som et enkeltcenter, prospektivt valideringsstudie.

METODER Delvis leverresektion er kirurgisk fjernelse af en del af leveren. De fleste partielle leverresektioner udføres til behandling af hepatiske neoplasmer. Patienter, der skal gennemgå en åben delvis leverresektionsoperation i vores institution, vil blive gennemgået med plejekredsens team og kontaktet for samtykke, hvis det skønnes egnet til denne undersøgelse.

En informeret samtykkeformular, der er godkendt af Nova Scotia Health Authority Research Ethics Board, vil blive brugt i samtykkediskussionen (drevet af den kliniske stipendiat eller forskningsmedarbejderen - som begge er efterforskere, der deltager i dette projekt), og patienterne vil få tid til at læse dokument i sin helhed, inden der anmodes om en beslutning om deltagelse. Patienter, der giver deres samtykke til undersøgelsen, vil blive tildelt undersøgelsesgruppen. Tildelingsprocessen fortsætter, indtil 25 patienter er inkluderet.

Undersøgelsesdeltagere vil gennemgå en præoperativ MR for fedtkvantificering. De vil blive bedt om at faste i mindst 8 timer før MR. Fedtkvantificeringsteknik (protondensitetsfedtfraktionsteknik) vil blive udført ved hjælp af IDEAL-pulssekvensen, som er blevet godkendt af Health Canada til vurdering af leverfedtfraktion, på en 3.0-T MR-enhed (GE 750; GE Healthcare). En tilstedeværende fellowship-uddannet abdominal radiolog, som har erfaring med MR-billedtolkning, vil måle leverfedtfraktionen (FF) på FF-kort, som genereres automatisk. Den automatisk beregnede hepatiske FF vil blive vist som en procentdel på en fuld skala fra 0-100.

Under leverresektionsproceduren vil et område af prøven, der skal fjernes, men ikke selve læsionen, blive belyst af Raman-spektroskopets fiberoptiske probe. Raman-spektrene tilvejebragt og optaget i realtid (inden for få sekunder) vil efterfølgende blive analyseret (hovedkomponentanalyse). Denne analyse vil give en pc-score.

Efter anvendelse af Raman-spektroskopi vil den operative procedure fortsætte som planlagt. Histokemiske pletter, H&E (hæmatoxylin-eosin) og trichrom, bruges rutinemæssigt til fortolkning af leverprøver i vores anatomiske patologiske laboratorium. Som en speciel plet skal Oil Red O bruges til at demonstrere tilstedeværelsen og omfanget af fedtet (dvs. fedtkvantificering) i levervæv. Da det kun kan udføres på frosne sektioner, vil en frosset sektion blive opnået fra den fjernede leverprøvesektion for at tillade Oil Red O-farvning-specifik til diagnosticering og kvantificering af fedtdråber. En behandlende patolog, der er blindet for MRI-resultaterne, vil evaluere disse sektioner og bestemme graden af ​​steatose i henhold til de internationale standarder:

M0: ingen makrovesikulær steatose M1: mild fokal makrovesikulær steatose (<30 % hepatocytter er involveret) M2: moderat, zoneformet makrovesikulær steatose (>30 og <60 % hepatocytter involveret) M3: svær, panlobulær makrovesikulær steatose (>60 % hepatocytter involveret) Korrelationsanalyse vil blive udført mellem lever-FF-procenter, PC-score og steatose-karakterer for hver undersøgelsesdeltager. Studiedeltagere vil blive fulgt efter operationen i henhold til vores standard opfølgningsprotokol efter leverresektion uden nogen afvigelser fra standarden for pleje.

STATISTISK ANALYSE Til statistisk analyse vil kvantitative data blive udtrykt som middel og standardafvigelser og kvalitative data vil blive udtrykt som tal. Lineær regression vil blive udført mellem makrovesikulær steatosis-grad og hepatisk FF-procenter og PC-score. Receiver operating characteristics (ROC)-kurver vil blive genereret for PC-score og lever-FF-procenter for at identificere deres evne til at forudsige graden af ​​makrovesikulær steatose. Al statistisk analyse vil blive udført med kommercielt tilgængelig statistisk software (XLSTAT 2014).

Personlige helbredsoplysninger vil ikke blive brugt til gennemførelsen af ​​dette projekt. Kodenumre vil blive tildelt hver deltager. En database, som kun vil være tilgængelig for efterforskerne, vil blive opbevaret på en sikker computer (kræver adgangskode) på transplantationskontoret (Queen Elizabeth II Health Sciences Centre, Victoria General Site, 4. sal, Dickson Building, værelse 4074). Denne database vil omfatte deltagernes kodenumre og dataelementerne såsom hepatisk FF-procent, PC-score og steatosis-grad.