Walidacja kliniczna spektroskopu Ramana w celu określenia zawartości tłuszczu wątrobowego

Obecnie istnieją trzy główne metody oceny stłuszczenia wątroby przed pobraniem wątroby od zmarłego dawcy: nieinwazyjne techniki obrazowania, ocena próbki biopsji wątroby przez doświadczonego patologa i ocena przez chirurga transplantologa.

Techniki obrazowania, które są obecnie w użyciu, obejmują ultrasonografię (USG), tomografię komputerową (CT) i obrazowanie metodą rezonansu magnetycznego (MRI). Chociaż USG ma akceptowalny poziom czułości, nie dostarcza powtarzalnych informacji ilościowych. Może być używany w większości ośrodków, ale jest zależny od operatora. Podobnie, skuteczność diagnostyczna tomografii komputerowej bez wzmocnienia w celu dokładnego określenia ilościowego stłuszczenia jest niewiarygodna. MRI jest wysoce czuły i swoisty w diagnozowaniu stłuszczenia wątroby i doniesiono, że oznaczanie ilościowe tłuszczu za pomocą 3,0-T MRI może zapewnić wystarczającą czułość do wykrywania i ilościowego określania stłuszczenia u kandydatów na żywych dawców wątroby. Jednak ta złożona technologia ogranicza jej zastosowanie w rutynowym pobieraniu narządów.

Mikroskopowa ocena próbki pobranej z biopsji wątroby przez doświadczonego patologa jest złotym standardem oceny stłuszczenia. Obecność i rodzaj stłuszczenia można określić na podstawie oceny mikroskopowej. Stopień stłuszczenia można określić zgodnie z międzynarodowymi standardami.

Pomimo tego, że jest to złoty standard, biopsje są rejestrowane tylko w przypadku 23% przeszczepionych wątrób w Stanach Zjednoczonych. Ponieważ patolog nie zawsze jest dostępny w momencie pobierania, wiele ośrodków polega głównie na ocenie stłuszczenia i jakości narządu przez chirurga pobierającego (tj. chirurg transplantolog). Podczas tej oceny wątrobę dawcy ocenia się według kryteriów tekstury miąższu, takich jak stopień zażółcenia (normalny, łagodny, umiarkowany, ciężki) i stopień jędrności (miękki, normalny; łagodny, umiarkowany, ciężki). Jednak badania, w których sprawdzano, jak dokładnie chirurg transplantolog może przewidzieć stłuszczenie wątroby, wykazały, że oceny te mogą być znacznie mylące nawet w doświadczonych rękach.

Ponieważ wszystkie te trzy metody mają swoje ograniczenia, istnieje potrzeba opracowania wygodnej i prostej techniki lepszej oceny zawartości tłuszczu w wątrobie przed przeszczepem. Spektroskopia ramanowska jest techniką nieelastycznego rozpraszania światła, która jest wrażliwa na drgania molekularne, których symetria i częstotliwości są unikalne dla rodzaju atomów i ich przestrzennego rozmieszczenia. Czułość na te właściwości jest podstawą jego zdolności do dostarczania spektralnego odcisku palca cząsteczek w oświetlanym obszarze. Stosowano go do wykrywania aminokwasów, zasad nukleotydowych, kwasów tłuszczowych, sacharydów, pierwotnych metabolitów i innych składników tworzących białka, węglowodany, tłuszcze i DNA/RNA tkanek biologicznych. Jest to atrakcyjna technologia do bioanalizy, ponieważ nie wymaga przygotowania próbki.

Spektroskopia Ramana jest obecnie badana pod kątem zastosowania w warunkach klinicznych i jest przeprowadzana głównie w celach diagnostycznych. Obecnie jest zatwierdzony do użytku w Kanadzie w diagnostyce raka skóry.

Istnieje wiele różnych systemów spektroskopii ramanowskiej. Niedawno zaprojektowaliśmy wysokowydajny system spektroskopii ramanowskiej, który jest mniejszy niż inne, przenośny i solidny. Umożliwia wykonywanie skanów tkanek in situ przy bardzo niewielkim doświadczeniu operatora. System ten wykorzystuje długość fali wzbudzenia w bliskiej podczerwieni (NIR), aby poprawić głębokość penetracji lasera, jednocześnie zmniejszając możliwość uszkodzenia tkanki. Dostarcza informacji w postaci widm ramanowskich, których analiza daje wynik głównego składnika (PC).

Ten specjalnie zaprojektowany system może dokładnie określić ilościowo stłuszczenie wątroby myszy i szczurów. Wyniki PC wykazywały istotną korelację z wynikami badania histopatologicznego. Ponieważ stłuszczenie w ludzkiej tkance wątroby wykazuje zmiany podobne do lewego płata wątroby myszy i szczurów, doszliśmy do wniosku, że technika ta może być zastosowana w dziedzinie transplantacji. Walidacja kliniczna, a następnie przyjęcie tej techniki może zapewnić specjalistom od przeszczepów cenne narzędzie do uzyskiwania w czasie rzeczywistym informacji na temat ciężkości stłuszczenia wątroby w celu oceny prawdopodobieństwa pomyślnego wyniku i zmniejszenia wskaźników niezamierzonego odrzucania narządów.

CEL Celem tego badania jest walidacja spektroskopii Ramana (za pomocą naszego specjalnie zaprojektowanego wysokoprzepustowego systemu światłowodowego Ramana) w warunkach klinicznych w ocenie zawartości tłuszczu w wątrobie. Widma ramanowskie in vivo (wyniki PC) zostaną porównane z wynikami przedoperacyjnej metody obrazowania (oznaczenie ilościowe tłuszczu MRI) i aktualnym złotym standardem, biopsją wątroby (tj. ocena histopatologiczna wycinka wątroby).

KONKRETNE PYTANIA BADAWCZE

1. Czy spektroskopia Ramana z wykorzystaniem przenośnego systemu światłowodowego może szybko ocenić zawartość tłuszczu w wątrobie in situ w warunkach klinicznych? 2. Czy widma Ramana (wyniki głównych składowych) są dobrze skorelowane z wynikami ilościowej oceny tłuszczu MRI i oceny histopatologicznej próbki biopsji wątroby? PROJEKT BADANIA: To badanie jest pomyślane jako jednoośrodkowe, prospektywne badanie walidacyjne.

METODY Częściowa resekcja wątroby to chirurgiczne usunięcie fragmentu wątroby. Większość częściowych resekcji wątroby wykonuje się w leczeniu nowotworów wątroby. Pacjenci, którzy zostaną poddani otwartej operacji częściowej resekcji wątroby w naszej placówce, zostaną przejrzeni przez zespół opiekuńczy i poproszeni o zgodę, jeśli zostaną uznani za odpowiednich do tego badania.

Formularz świadomej zgody Urzędu ds. Etyki Badań Naukowych Urzędu ds. Zdrowia Nowej Szkocji, zatwierdzony przez Radę ds. Etyki Badań, zostanie wykorzystany w dyskusji na temat zgody (prowadzonej przez pracownika klinicznego lub współpracownika naukowego — obaj są badaczami uczestniczącymi w tym projekcie), a pacjenci otrzymają czas na zapoznanie się z treścią dokumentu w całości, zanim zostanie poproszony o podjęcie decyzji o uczestnictwie. Pacjenci, którzy wyrażą zgodę na badanie, zostaną przydzieleni do grupy badawczej. Proces przydziału będzie trwał do momentu uwzględnienia 25 pacjentów.

Uczestnicy badania zostaną poddani przedoperacyjnemu badaniu MRI w celu ilościowego określenia zawartości tłuszczu. Zostaną poproszeni o poszczenie przez co najmniej 8 godzin przed MRI. Technika oznaczania ilościowego tłuszczu (technika frakcji tłuszczu protonowej gęstości) zostanie przeprowadzona przy użyciu sekwencji impulsów IDEAL, która została zatwierdzona przez Health Canada do oceny frakcji tłuszczu wątrobowego, na urządzeniu MR 3,0-T (GE 750; GE Healthcare). Uczestniczący w programie radiolog jamy brzusznej, który ma doświadczenie w interpretacji obrazów MR, zmierzy frakcję tłuszczu wątrobowego (FF) na mapach FF, które zostaną wygenerowane automatycznie. Automatycznie obliczona wątrobowa FF zostanie wyświetlona jako procent w pełnej skali 0-100.

Podczas procedury resekcji wątroby obszar próbki, który ma zostać usunięty, ale nie właściwa zmiana, zostanie oświetlony przez sondę światłowodową spektroskopu ramanowskiego. Widma Ramana dostarczone i zarejestrowane w czasie rzeczywistym (w ciągu kilku sekund) zostaną następnie poddane analizie (analiza głównych składowych). Ta analiza zapewni wynik PC.

Po zastosowaniu spektroskopii Ramana procedura operacyjna będzie kontynuowana zgodnie z planem. Barwienie histochemiczne, H&E (hematoksylina-eozyna) i trichrom są rutynowo stosowane do interpretacji próbek wątroby w naszym laboratorium patologii anatomicznej. W celu wykazania obecności i stopnia zatłuszczenia (tj. oznaczanie ilościowe tłuszczu) w tkance wątroby. Ponieważ można to wykonać tylko na zamrożonych skrawkach, zamrożony skrawek zostanie pobrany z usuniętego skrawka wątroby, aby umożliwić barwienie czerwienią olejową O — specyficzną dla diagnozowania i ilościowego oznaczania kropelek tłuszczu. Prowadzący patolog, który nie zna wyników MRI, oceni te sekcje i określi stopień stłuszczenia zgodnie z międzynarodowymi standardami:

M0: brak stłuszczenia makropęcherzykowego M1: łagodne ogniskowe stłuszczenie makropęcherzykowe (zajęcie <30% hepatocytów) M2: umiarkowane, strefowe stłuszczenie makropęcherzykowe (zajęcie >30 i <60% hepatocytów) M3: ciężkie, panlobularne stłuszczenie makropęcherzykowe (zajęcie >60% hepatocytów) Analiza korelacji zostanie przeprowadzona między procentami wątrobowego FF, wynikami PC i stopniami stłuszczenia dla każdego uczestnika badania. Uczestnicy badania będą obserwowani po operacji zgodnie z naszym standardowym protokołem obserwacji po resekcji wątroby, bez żadnych odchyleń od standardu opieki.

ANALIZA STATYSTYCZNA W przypadku analizy statystycznej dane ilościowe zostaną wyrażone jako średnie i odchylenia standardowe, a dane jakościowe zostaną wyrażone jako liczby. Zostanie przeprowadzona regresja liniowa między stopniem stłuszczenia makropęcherzykowego a procentami FF wątroby i wynikami PC. Krzywe charakterystyki operacyjnej odbiornika (ROC) zostaną wygenerowane dla wyników PC i procentów FF wątroby w celu określenia ich zdolności do przewidywania stopnia stłuszczenia makropęcherzykowego. Wszystkie analizy statystyczne zostaną przeprowadzone za pomocą dostępnego na rynku oprogramowania statystycznego (XLSTAT 2014).

Dane osobowe dotyczące zdrowia nie będą wykorzystywane do realizacji tego projektu. Każdemu uczestnikowi zostaną przydzielone numery kodów. Baza danych, do której będą mieli dostęp tylko badacze, będzie przechowywana na zabezpieczonym komputerze (wymagającym podania hasła) w gabinecie transplantacyjnym (Queen Elizabeth II Health Sciences Centre, Victoria General Site, 4th floor, Dickson Building, Room 4074). Ta baza danych będzie zawierać numery kodów uczestników i elementy danych, takie jak odsetek wątrobowego FF, wynik PC i stopień stłuszczenia.