Klinisk validering av et Raman-spektroskop for å bestemme fettinnhold i leveren

For tiden er det rapportert tre hovedmetoder for å vurdere leversteatose før leveruthenting av avdøde donorer: Ikke-invasive avbildningsteknikker, evaluering av en leverbiopsiprøve av en erfaren patolog og vurdering av transplantasjonskirurg.

Bildeteknikker som for tiden er i bruk inkluderer ultrasonografi (USG), datastyrt tomografi (CT) og magnetisk resonanstomografi (MRI). Selv om den har et akseptabelt sensitivitetsnivå, gir ikke USG reproduserbar kvantitativ informasjon. Den kan brukes i de fleste sentre, men den er operatøravhengig. På samme måte er den diagnostiske ytelsen til ikke-forbedret CT-skanning for nøyaktig kvantifisering av steatose upålitelig. MR er svært sensitiv og spesifikk for å diagnostisere leversteatose, og det er rapportert at fettkvantifisering ved bruk av en 3,0-T MR kan gi tilstrekkelig følsomhet til å oppdage og kvantifisere steatose hos levende leverdonorkandidater. Imidlertid begrenser denne komplekse teknologien bruken i rutinemessig organanskaffelse.

Den mikroskopiske evalueringen av en leverbiopsiprøve av en ekspertpatolog er gullstandarden for steatosevurdering. Tilstedeværelsen og typen av steatose kan bestemmes ved mikroskopisk evaluering. Graden av steatose kan bestemmes i henhold til internasjonale standarder.

Til tross for at de er gullstandard, blir biopsier registrert for bare 23% av transplanterte lever i USA. Siden en patolog ikke alltid er tilgjengelig på anskaffelsestidspunktet, stoler mange sentre hovedsakelig på vurdering av steatose og organkvalitet av anskaffelseskirurgen (dvs. transplantasjonskirurg). Under denne vurderingen blir donorleveren evaluert i henhold til parenkymale teksturkriterier som gulhet (normal, mild, moderat, alvorlig) og fasthetsgrad (myk, normal; mild, moderat, alvorlig). Studier som undersøkte hvor nøyaktig en transplantasjonskirurg kunne forutsi leversteatose konkluderte imidlertid med at disse vurderingene kunne være betydelig misvisende selv i erfarne hender.

Siden alle disse tre metodene har sine begrensninger, er det behov for en praktisk og enkel teknikk for bedre å vurdere leverfettinnholdet før transplantasjon. Raman-spektroskopi er en uelastisk lysspredningsteknikk som er følsom for molekylære vibrasjoner, hvis symmetri og frekvenser er unike for typen atomer og deres romlige arrangement. Følsomhet for disse egenskapene er grunnlaget for dens evne til å gi et spektralt fingeravtrykk av molekyler i det opplyste området. Det har blitt brukt til å oppdage aminosyrer, nukleotidbaser, fettsyrer, sakkarider, primære metabolitter og andre bestanddeler som danner protein, karbohydrater, fett og DNA/RNA i biologisk vev. Det er en attraktiv teknologi for bioanalyse fordi det ikke er nødvendig med prøvepreparering.

Raman-spektroskopi er for tiden under utredning for bruk i kliniske omgivelser, og den utføres hovedsakelig for diagnostiske formål. Det er for tiden godkjent for bruk i Canada for hudkreftdiagnose.

Det finnes en rekke forskjellige Raman-spektroskopisystemer. Vi har nylig designet et Raman-spektroskopisystem med høy gjennomstrømning som er mindre enn de andre, bærbart og robust. Det gjør det mulig å utføre in situ skanninger av vev med svært liten erfaring som kreves av operatøren. Dette systemet bruker 'nær infrarød (NIR) eksitasjonsbølgelengde for å forbedre penetrasjonsdybden til laseren samtidig som det reduserer muligheten for vevsskade. Den gir informasjon i form av Raman-spektra, analyse av disse gir en Principal Component (PC)-score.

Dette spesialdesignede systemet kunne nøyaktig kvantifisere steatose hos mus og rottelever. PC-skårene viste en signifikant korrelasjon med histopatologiske undersøkelsesresultater. Siden steatose i humant levervev viser endringer som ligner på venstre leverlapp hos mus og rotter, konkluderte vi med at denne teknikken kunne brukes på transplantasjonsfeltet. Klinisk validering og påfølgende bruk av denne teknikken kan gi transplantasjonsspesialister et verdifullt verktøy for å få sanntidsinformasjon om alvorlighetsgraden av hepatisk steatose for å vurdere sannsynligheten for et vellykket resultat og redusere antallet utilsiktede organkassering.

MÅL Målet med denne studien er å validere Raman-spektroskopi (ved hjelp av vårt spesialdesignede høykapasitets fiberoptiske Raman-system) i en klinisk setting for å vurdere leverfettinnholdet. In vivo Raman-spektra (PC-score) vil bli sammenlignet med funnene fra en preoperativ bildebehandlingsmetode (MRI-fettkvantifisering) og gjeldende gullstandard, leverbiopsi (dvs. histopatologisk vurdering av leverprøven).

SPESIFIKKE FORSKNINGSSPØRSMÅL

1. Kan Raman-spektroskopi ved bruk av et bærbart fiberoptisk system raskt vurdere fettinnholdet i leveren in situ i kliniske omgivelser? 2. Korrelerer Raman-spektra (hovedkomponentskår) godt med funnene av MR-fettkvantifisering og histopatologisk vurdering av leverbiopsiprøven? STUDIEDESIGN: Denne studien er tenkt som en enkeltsenter, prospektiv valideringsstudie.

METODER Delvis leverreseksjon er kirurgisk fjerning av en del av leveren. De fleste partielle leverreseksjoner utføres for behandling av hepatiske neoplasmer. Pasienter som skal gjennomgå en åpen delvis leverreseksjonsoperasjon i vår institusjon vil bli gjennomgått med sirkelen av omsorgsteamet og kontaktet for samtykke dersom det anses egnet for denne studien.

Et informert samtykkeskjema godkjent av Nova Scotia Health Authority Research Ethics Board vil bli brukt i samtykkediskusjonen (drevet av den kliniske stipendiaten eller forskningsmedarbeideren - som begge er etterforskere som deltar i dette prosjektet) og pasientene vil få tid til å lese dokument i sin helhet før det blir bedt om vedtak om deltakelse. Pasienter som gir sitt samtykke til studien vil bli tildelt studiegruppen. Oppdragsprosessen vil fortsette inntil 25 pasienter er inkludert.

Studiedeltakere vil gjennomgå en preoperativ MR for fettkvantifisering. De vil bli bedt om å faste i minst 8 timer før MR. Fettkvantifiseringsteknikk (protondensity fettfraksjonsteknikk) vil bli utført ved å bruke IDEAL-pulssekvensen, som har blitt Health Canada-godkjent for vurdering av leverfettfraksjon, på en 3.0-T MR-enhet (GE 750; GE Healthcare). En møtende stipendiatutdannet abdominal radiolog som har erfaring med MR-bildetolking vil måle leverfettfraksjonen (FF) på FF-kart, som genereres automatisk. Den automatisk beregnede hepatiske FF vil vises som en prosentandel på en full skala fra 0-100.

Under leverreseksjonsprosedyren vil et område av prøven som skal fjernes, men ikke selve lesjonen, bli belyst av Raman-spektroskopets fiberoptiske sonde. Raman-spektrene som leveres og registreres i sanntid (innen noen få sekunder) vil deretter bli analysert (hovedkomponentanalyse). Denne analysen vil gi en PC-score.

Etter bruk av Raman-spektroskopi vil den operative prosedyren fortsette som planlagt. Histokjemiske flekker, H&E (hematoxylin-eosin) og trikrom, brukes rutinemessig for tolkning av leverprøver i vårt anatomiske patologilaboratorium. Som en spesiell beis må Oil Red O brukes for å demonstrere tilstedeværelsen og omfanget av fettet (dvs. fettkvantifisering) i levervev. Siden det kun kan utføres på frosne seksjoner, vil en fryst seksjon bli hentet fra den fjernede leverprøveseksjonen for å tillate Oil Red O-farging-spesifikk for diagnostisering og kvantifisering av fettdråper. En behandlende patolog som er blindet for MR-funnene vil evaluere disse seksjonene og bestemme graden av steatose i henhold til internasjonale standarder:

M0: ingen makrovesikulær steatose M1: mild fokal makrovesikulær steatose (<30 % hepatocytter er involvert) M2: moderat, sonal makrovesikulær steatose (>30 og <60 % hepatocytter involvert) M3: alvorlig, panlobulær makrovesikulær steatose (>60 % hepatocytter involvert) Korrelasjonsanalyse vil bli utført mellom hepatisk FF-prosent, PC-score og steatosekarakterer for hver studiedeltaker. Studiedeltakere vil bli fulgt etter operasjonen i henhold til vår standard oppfølgingsprotokoll etter leverreseksjon uten noen avvik fra standarden for omsorg.

STATISTISK ANALYSE For statistisk analyse vil kvantitative data uttrykkes som gjennomsnitt og standardavvik og kvalitative data vil uttrykkes som tall. Lineær regresjon vil bli utført mellom makrovesikulær steatose-grad og hepatisk FF-prosent og PC-score. Receiver operating characteristics (ROC)-kurver vil bli generert for PC-skårene og lever-FF-prosentene for å identifisere deres evne til å forutsi graden av makrovesikulær steatose. All statistisk analyse vil bli utført med kommersielt tilgjengelig statistisk programvare (XLSTAT 2014).

Personlig helseinformasjon vil ikke bli brukt til gjennomføringen av dette prosjektet. Kodenummer vil bli tildelt hver deltaker. En database som kun vil være tilgjengelig for etterforskerne vil bli lagret på en sikret datamaskin (krever passord) på transplantasjonskontoret (Queen Elizabeth II Health Sciences Centre, Victoria General Site, 4. etasje, Dickson Building, rom 4074). Denne databasen vil inkludere kodenumrene til deltakerne og dataelementene som hepatisk FF-prosent, PC-score og steatosegrad.