Raman-spektroskoopin kliininen validointi maksan rasvapitoisuuden määrittämiseksi

Tällä hetkellä on raportoitu kolmea päämenetelmää maksan rasvakudoksen arvioimiseksi ennen kuolleen luovuttajan maksan noutoa: Ei-invasiiviset kuvantamistekniikat, kokeneen patologin suorittama maksan biopsianäytteen arviointi ja siirtokirurgin suorittama arviointi.

Tällä hetkellä käytössä olevia kuvantamistekniikoita ovat ultraääni (USG), tietokonetomografia (CT) ja magneettikuvaus (MRI). Vaikka sen herkkyys on hyväksyttävällä tasolla, USG ei anna toistettavissa olevia kvantitatiivisia tietoja. Sitä voidaan käyttää useimmissa keskuksissa, mutta se on operaattorista riippuvainen. Samoin tehostamattoman CT-skannauksen diagnostinen suorituskyky steatoosin tarkkaan kvantifiointiin on epäluotettava. MRI on erittäin herkkä ja spesifinen maksan steatoosin diagnosoinnissa, ja on raportoitu, että rasvan kvantifiointi 3,0-T MRI:llä voi tarjota riittävän herkkyyden havaita ja kvantifioida steatoosi elävillä maksanluovuttajilla. Tämä monimutkainen tekniikka kuitenkin rajoittaa sen käyttöä rutiininomaisessa elinten hankinnassa.

Ammattipatologin suorittama maksan biopsianäytteen mikroskooppinen arviointi on steatoosin arvioinnin kultainen standardi. Steatoosin esiintyminen ja tyyppi voidaan määrittää mikroskooppisella arvioinnilla. Steatoosin aste voidaan määrittää kansainvälisten standardien mukaan.

Huolimatta kultastandardista, biopsiat kirjataan vain 23 %:sta maksansiirroista Yhdysvalloissa. Koska patologia ei aina ole saatavilla hankintahetkellä, monet keskukset luottavat pääasiassa steatoosin ja elinten laadun arvioon hankintakirurgin (esim. elinsiirtokirurgi). Tämän arvioinnin aikana luovuttajan maksa arvioidaan parenkymaalisen rakenteen kriteerien, kuten keltaisuusasteen (normaali, lievä, kohtalainen, vaikea) ja kiinteysasteen (pehmeä, normaali; lievä, kohtalainen, vaikea) mukaan. Kuitenkin tutkimukset, joissa selvitettiin, kuinka tarkasti siirtokirurgi pystyi ennustamaan maksan rasvakudosta, päättelivät, että nämä arviot voivat olla merkittävästi harhaanjohtavia jopa kokeneissa käsissä.

Koska kaikilla näillä kolmella menetelmällä on rajoituksensa, tarvitaan kätevä ja yksinkertainen tekniikka maksan rasvapitoisuuden arvioimiseksi paremmin ennen siirtoa. Raman-spektroskopia on joustamaton valonsirontatekniikka, joka on herkkä molekyylivärähtelyille, joiden symmetria ja taajuudet ovat ainutlaatuisia atomityypeille ja niiden tilajärjestelylle. Herkkyys näille ominaisuuksille on perusta sen kyvylle tarjota spektrinen sormenjälki molekyyleistä valaistulla alueella. Sitä on käytetty aminohappojen, nukleotidiemästen, rasvahappojen, sakkaridien, primaaristen metaboliittien ja muiden aineosien havaitsemiseen, jotka muodostavat biologisten kudosten proteiinin, hiilihydraatit, rasvat ja DNA/RNA:n. Se on houkutteleva teknologia bioanalyysiin, koska näytteen valmistelua ei tarvita.

Raman-spektroskopiaa tutkitaan parhaillaan käytettäväksi kliinisissä olosuhteissa ja sitä tehdään pääasiassa diagnostisiin tarkoituksiin. Se on tällä hetkellä hyväksytty käytettäväksi Kanadassa ihosyövän diagnosoinnissa.

On olemassa useita erilaisia ​​Raman-spektroskopiajärjestelmiä. Olemme äskettäin suunnitelleet korkean suorituskyvyn Raman-spektroskopiajärjestelmän, joka on muita pienempi, kannettava ja kestävä. Se mahdollistaa kudosten in situ -skannaukset ilman, että käyttäjältä vaaditaan hyvin vähän kokemusta. Tämä järjestelmä käyttää lähi-infrapuna (NIR) viritysaallonpituutta laserin tunkeutumissyvyyden parantamiseksi ja samalla vähentää kudosvaurioiden mahdollisuutta. Se antaa tietoa Raman-spektrien muodossa, jonka analyysi antaa pääkomponentin (PC) pistemäärän.

Tämä erityisesti suunniteltu järjestelmä voisi tarkasti määrittää hiirten ja rotan maksan rasvakudoksen. PC-pisteet osoittivat merkittävää korrelaatiota histopatologisten tutkimustulosten kanssa. Koska rasvakudoksessa ihmisen maksakudoksessa on samanlaisia ​​muutoksia kuin hiirten ja rottien vasemmassa maksalohkossa, päätimme, että tätä tekniikkaa voitaisiin soveltaa elinsiirtojen alalla. Tämän tekniikan kliininen validointi ja myöhempi käyttöönotto voivat tarjota elinsiirtoasiantuntijoille arvokkaan työkalun saada reaaliaikaista tietoa maksan steatoosin vakavuudesta, jotta voidaan arvioida onnistuneen lopputuloksen todennäköisyys ja vähentää tahattomien elinten hylkäämistä.

TAVOITE Tämän tutkimuksen tavoitteena on validoida Raman-spektroskopia (erityisesti suunnitellun korkean suorituskyvyn kuituoptisen Raman-järjestelmän avulla) kliinisessä ympäristössä maksan rasvapitoisuuden arvioinnissa. In vivo Raman -spektrejä (PC-pisteitä) verrataan leikkausta edeltävän kuvantamismenetelmän (MRI-rasvan kvantifiointi) ja nykyisen kultastandardin, maksabiopsian (ts. maksanäytteen histopatologinen arviointi).

ERITYISET TUTKIMUSKYSYMYKSET

1. Voiko kannettavaa valokuitujärjestelmää hyödyntävä Raman-spektroskopia arvioida nopeasti maksan rasvapitoisuuden in situ kliinisissä olosuhteissa? 2. Korreloivatko Raman-spektrit (pääkomponenttien pisteet) hyvin MRI-rasvan kvantifioinnin ja maksabiopsianäytteen histopatologisen arvioinnin tulosten kanssa? TUTKIMUKSEN SUUNNITTELU: Tämä tutkimus on suunniteltu yhden keskuksen prospektiiviseksi validointitutkimukseksi.

MENETELMÄT Osittainen maksaresektio on maksan osan kirurginen poistaminen. Suurin osa maksan osittaisista resektioista tehdään maksakasvainten hoitoon. Potilaat, joille tehdään avoin osittainen maksan resektioleikkaus laitoksessamme, käydään läpi hoitotiimin kanssa, ja heiltä pyydetään suostumus, jos katsotaan sopivaksi tähän tutkimukseen.

Suostumuskeskustelussa käytetään Nova Scotia Health Authority Research Ethics Boardin hyväksymää tietoon perustuvaa suostumuslomaketta (jota hoitaa kliininen stipendiaatti tai tutkija - jotka molemmat osallistuvat tähän projektiin tutkijoina) ja potilaille annetaan aikaa lukea asiakirja kokonaisuudessaan ennen kuin heiltä pyydetään päätöstä osallistumisesta. Potilaat, jotka antavat suostumuksensa tutkimukseen, määrätään tutkimusryhmään. Toimeksiantoprosessi jatkuu, kunnes mukaan otetaan 25 potilasta.

Tutkimukseen osallistujille tehdään ennen leikkausta MRI rasvan määrittämiseksi. Heitä pyydetään paastoamaan vähintään 8 tuntia ennen magneettikuvausta. Rasvan kvantifiointitekniikka (protonitiheysrasvafraktiotekniikka) suoritetaan käyttämällä IDEAL-pulssisekvenssiä, joka on Health Canadan hyväksymä maksan rasvafraktion arviointiin, 3.0-T MR-yksiköllä (GE 750; GE Healthcare). Osallistuva stipendiaattikoulutettu vatsaradiologi, jolla on kokemusta MR-kuvan tulkinnasta, mittaa maksan rasvafraktion (FF) FF-kartoilla, jotka luodaan automaattisesti. Automaattisesti laskettu maksan FF näytetään prosentteina täydellä asteikolla 0-100.

Maksan resektiotoimenpiteen aikana näytteen alue, joka on poistettava, mutta ei varsinaista vauriota, valaisee Raman-spektroskooppikuituoptisella anturilla. Reaaliajassa (muutaman sekunnin sisällä) saadut ja tallennetut Raman-spektrit analysoidaan myöhemmin (pääkomponenttianalyysi). Tämä analyysi antaa PC-pisteet.

Raman-spektroskopian soveltamisen jälkeen operaatio jatkuu suunnitellusti. Histokemiallisia värjäyksiä, H&E (hematoksyliini-eosiini) ja trikromi, käytetään rutiininomaisesti maksanäytteiden tulkinnassa anatomisen patologian laboratoriossamme. Erityisenä tahrana on käytettävä Oil Red O:ta rasvan läsnäolon ja laajuuden osoittamiseksi (esim. rasvan kvantifiointi) maksakudoksessa. Koska se voidaan suorittaa vain pakastetuille leikkeille, jäädytetty leike saadaan poistetusta maksanäytteestä, jotta voidaan tehdä Oil Red O -värjäys, joka on spesifinen rasvapisaroiden diagnosointiin ja kvantifiointiin. Hoitava patologi, joka on sokea MRI-löydöksille, arvioi nämä osat ja määrittää steatoosin asteen kansainvälisten standardien mukaisesti:

M0: ei makrovesikulaarista steatoosia M1: lievä fokaalinen makrovesikulaarinen steatoosi (<30 % hepatosyyttejä mukana) M2: kohtalainen, vyöhykkeellinen makrovesikulaarinen steatoosi (>30 ja <60 % hepatosyyttejä) M3: vaikea, panlobulaarinen makrovesikulaarinen steatoosi (>60 % hepatosyytit mukana) Korrelaatioanalyysi suoritetaan maksan FF-prosenttiosuuksien, PC-pisteiden ja steatoosiluokkien välillä jokaiselle tutkimukseen osallistujalle. Tutkimukseen osallistujia seurataan leikkauksen jälkeen normaalin maksaresektion jälkeisen seurantaprotokollamme mukaisesti ilman poikkeamia hoidon tasosta.

TILASTOINEN ANALYYSI Tilastollista analyysiä varten kvantitatiiviset tiedot ilmaistaan ​​keskiarvoina ja keskihajonnat ja kvalitatiiviset tiedot numeroina. Lineaarinen regressio suoritetaan makrovesikulaarisen steatoosin asteen ja maksan FF-prosenttiosuuksien ja PC-pisteiden välillä. Vastaanottimen toimintaominaisuuksien (ROC) käyrät luodaan PC-pisteille ja maksan FF-prosenttiosuuksille, jotta voidaan tunnistaa niiden kyky ennustaa makrovesikulaarisen steatoosin astetta. Kaikki tilastoanalyysit suoritetaan kaupallisesti saatavilla olevalla tilastoohjelmistolla (XLSTAT 2014).

Henkilökohtaisia ​​terveystietoja ei käytetä tämän projektin toteuttamiseen. Jokaiselle osallistujalle annetaan koodinumerot. Tietokanta, joka on vain tutkijoiden käytettävissä, tallennetaan suojattuun tietokoneeseen (vaatii salasanan syöttämisen) elinsiirtotoimistossa (Queen Elizabeth II Health Sciences Centre, Victoria General Site, 4. kerros, Dickson Building, Room 4074). Tämä tietokanta sisältää osallistujien koodinumerot ja tietoelementit, kuten maksan FF-prosenttiosuuden, PC-pisteet ja steatoositason.